Apéndice B — NOM-127-SSA1-2021, Agua para uso y consumo humano. Límites permisibles de la calidad del agua.

APÉNDICE B NORMATIVO

Métodos de prueba

B.1 MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE MICROCISTINA EN AGUA PARA USO Y CONSUMO

HUMANO

Para el cumplimiento de esta Norma, se deberá utilizar el método de ELISA cualitativo de respuesta rápida

(screening) para la determinación de microcistinas y nodularinas totales, contenido en el punto B.1.1 de este

Apéndice).

En caso de que dicho método resulte en la ausencia de microcistinas o nodularinas totales no será

necesario llevar a cabo ningún método confirmatorio adicional.

En caso de que dicho método resulte en la presencia de microcistinas o nodularinas totales deberá de

llevarse a cabo alguno de los dos métodos cuantitativos confirmatorios siguientes:

● Método para la determinación de microcistinas y nodularinas en agua de uso y consumo humano por

extracción en fase sólida y cromatografía líquida/espectrometría de masas en tándem (LC/MS/MS),

contenido en el punto B.1.2 de este Apéndice.

● Método para la determinación de microcistina mediante SPE y la cromatografía de líquidos de alto

rendimiento (HPLC) con detección (UV) ultravioleta, contenido en el punto B.1.3 de este Apéndice.

Sin embargo, para la determinación de microcistina -LR podrá optarse por det erminar directamente dicha

sustancia a través de los métodos confirmatorios cuantitativos descritos en los puntos B.1.2 y B.1.3 de este

Apéndice, sin llevar a cabo el método de screening ELISA (B.1.1, de este Apéndice).

B.1.1 MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE MICROCISTINAS Y NODULARINAS TOTALES EN

AGUA DE USO Y CONSUMO HUMANO MEDIANTE EL ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO ADDA

B.1.1.1 Definiciones y términos

Agua grado reactivo, al agua purificada que no contiene ninguna cantidad cuantificable de microcistinas,

nodularinas o compuestos que interfieran en o por encima de la media del MRL.

Blanco de reactivo de laboratorio (LRB) , a la alícuota de agua grado reactivo lisada y filtrada para

coincidir en el mismo procedimiento analítico utilizado para las muestras de campo. El LRB se utiliza para

determinar si se introducen microcistinas u otras interferencias por medio de los recipientes de la muestra, los

equipos de procesamiento de muestras o los reactivos utilizados en el ensayo.

Blanco fortificado de laboratorio (LFB) , a la alícuota de agua grado reactivo a la que se añade una

cantidad conocida de MC -LR. El LFB es lisado y filtrado para coincidir en el mismo procedimiento analítico

utilizado para las muestras de campo. El LFB se utiliza durante la IDC para verificar el re ndimiento del método

con precisión y exactitud. El LFB también es un elemento de control de calidad requerido con cada lote de

análisis. Los resultados del LFB verifican el rendimiento del método en ausencia de matriz de muestra.

Concentración más baja del nivel mínimo reportado (LCMRL), al punto de concentración más baja, tal

que la probabilidad de recobro se encuentre entre el 50 y 150% con al menos 99% de confianza.

Curva de calibración , a los puntos de calibración se modelan utilizando una función logís tica de cuatro

parámetros, relacionando la concentración (eje x) con la absorbancia medida en los pozos (eje y). A

continuación se presenta un ejemplo de curva de calibración generada durante el desarrollo del método. Es

importante observar la relación inversa entre la concentración y la respuesta (absorbancia).

Lisado, a la mezcla de sustancias formada por el material liberado cuando las células son fragmentadas

por enzimas, químicos inorgánicos o medios físicos.

Fig. B.1.1-1. Curva de calibración de ELISA con cálculo de la EC50. El eje x se encuentra en escala

logarítmica.

El estándar de calibración cero proporciona la absorbancia más alta y el estándar de calibración más alto

proporciona la absorbancia más baja. De igual manera, es importante observar también que la pendiente, o

sensibilidad, de la respuesta ELISA es mayor en el centro de la curva y tiende a una pendiente de cero a

concentraciones extremadamente bajas y altas. Para una explicación más detallada del modelo de calibración

de cuatro parámetros pueden revisarse referencias específicas como Maciel (1985) y Sasaki (2016).

Ecuación logística de cuatro parámetros:

En donde:

y absorbancia

x concentración

a absorbancia en la meseta inferior

b pendiente en el punto de inflexión

c concentración en el punto de inflexión = EC50

d absorbancia en la meseta superior

Los coeficientes a, b, c y d, son calculados por el software de reducción de datos usando análisis de

regresión.

Duplicado de la matriz de muestra fortificada en laboratorio (LFSMD) , a la segunda alícuota de la

muestra de campo utilizada para preparar el LFSM que se fortifica y ensaya en el mismo lote de análisis que

el LFSM. El LFSMD se utiliza para verificar la precisión del método en las matrices de agua de uso y consumo

humano.

EC50, a la concentración de microcistina que produce una absorbancia media entre la meseta inferior de la

curva de calibración (coeficiente a) y la meseta superior (coeficiente d). La EC 50 es la concentración en el

punto de inflexión (Fig. B.1.1 -1 de este Apén dice B) y está en el centro del intervalo de medición más

confiable (es decir, la mayor pendiente) de la ELISA.

Para cada curva de calibración, la EC 50 es igual al coeficiente c, del ajuste logístico de cuatro parámetros.

El EC50 se encuentra en el informe de calibración generado por el lector de placas.

Debido a que la EC 50 está en el centro del intervalo de medición más confiable, la guía para fortificar

muestras de control de calidad se basa en este valor. Para este método, las muestras de control de cal idad

que requieren ser fortificadas con MC -LR deben tener concentraciones cerca de la EC 50. Estas muestras de

control de calidad incluyen blancos fortificados de laboratorio y matriz de muestras fortificadas de laboratorio.

Estándar de calibración, soluciones de MC -LR suministradas en el kit de la prueba de ELISA o

preparadas en el laboratorio, que son apropiadas para el rango de medición del kit de ELISA.

Solución estándar de dilución primaria (PDS) , solución de MC -LR en metanol (o el indicado por el

fabricante) preparado a partir de la solución estándar MC -LR. Las soluciones de PDS se utilizan para fortificar

muestras de control de calidad (LFB, LFSM y LFSMD).

Estándar de verificación de calibración de bajo alcance (LOW -CV), estándar de calibración con una

concentración igual o inferior al MRL. El propósito de la LOW -CV es confirmar la exactitud de la calibración en

concentraciones cercanas al MRL.

Lote de análisis , los estándares, muestras y elementos de control de calidad se ensayan en una sola

placa de 9 6 pozos usando lotes idénticos de reactivos y pozos. Cada placa por definición es un lote de

análisis, independientemente del número de pozos incluidos. Las muestras de control de calidad deben

analizarse en cada lote de análisis a las frecuencias descrita s. Cada lote de análisis incluye los siguientes

elementos:

• Estándares de calibración

• Blancos de reactivo de laboratorio

• Estándar de verificación de calibración de bajo alcance

• Blancos fortificados de laboratorio

• Muestras de campo (agua de uso y consumo humano)

• Matriz de muestras fortificadas en laboratorio y duplicados de las matrices de muestras fortificadas en

laboratorio.

Matriz de muestra fortificada en laboratorio (LFSM) , alícuota de una muestra de campo a la que se

añade una cantidad cono cida de MC -LR. El propósito de la LFSM es determinar si la matriz de la muestra

contribuye a los resultados analíticos.

Muestra de control de calidad (QCS) , solución que contiene MC -LR en una concentración conocida que

se obtiene de una fuente diferente de la fuente de los estándares de calibración. El propósito de la QCS es

verificar la exactitud de los estándares de calibración primaria.

Nivel mínimo reportado (MRL) , concentración mínima que puede ser reportada por un laboratorio como

un valor cuantificad o para microcistinas y nodularinas totales en una muestra después del análisis. Esta

concentración no debe ser inferior a la concentración del estándar de calibración más bajo y debe cumplir con

los criterios de control de calidad.

Pozos r éplica, dentro de l lote de análisis, este método requiere que cada estándar de calibración,

muestra de campo y muestra de control de calidad se ensayen en dos pozos. Estos dos pozos se denominan

pozos réplica. A cada pozo réplica se asocian dos valores: la absorbancia medi da por el lector de placas y la

concentración calculada a partir de esta absorbancia.

Para cada conjunto de pozos ré plica, el coeficiente de variación porcentual (% CV) se calcula a partir de

los dos valores de absorbancia. El %CV de los valores de absorba ncia para los estándares de calibración

debe cumplir con los criterios de control de calidad especificados. El %CV de los valores de absorbancia para

todas las muestras de campo y las muestras de control de calidad deben cumplir con los criterios de contro l

de calidad.

Para cada conjunto de pozos replica, se calcula la concentración media de los dos valores de

concentración. La concentración media debe usarse para reportar los resultados de la muestra de campo. La

media debe utilizarse en todos los cálculos del método y para evaluar los resultados con respecto a los límites

de control de calidad.

Solución estándar, estándar concentrado en metanol (o el indicado por el fabricante) que se prepara en

el laboratorio a partir de MC -LR purificada o que se adquiere de una fuente comercial con un certificado de

análisis.

B.1.1.2 Símbolos y términos abreviados

(4E, 6E) posición espacial de los alquenos en la molécula

°C grado Celsius

DPD N, N-dietil-p-fenilendiamina

IDC demostración inicial de capacidad

LCMRL concentración más baja del nivel mínimo reportado

LFB blanco fortificado de laboratorio

LFSM matriz de muestra fortificada en laboratorio

LFSMD duplicado de la matriz de muestra fortificada en laboratorio

LOW-CV estándar de verificación de calibración de bajo alcance

LRB blanco de reactivo de laboratorio

MC microcistina

MC/NOD relación microcistina entre nodularina

MC-LR microcistina-LR

mm milímetro

MRL nivel mínimo reportado

µg/ml microgramo/mililitro

µm micrómetro

µL microlitro

nm nanómetro

NOD nodularina

NOD-R Nodularina-R

PDS solución estándar de dilución primaria

PIR intervalo de predicción de resultados

PTFE politetrafluoroetileno

QCS muestra de control de calidad

RPD diferencia porcentual relativa

r2 cuadrado del coeficiente de correlación

% por ciento

%CV coeficiente de variación porcentual

%R porcentaje promedio de recuperación

%RSD porcentaje de desviación estándar relativa

≤ menor o igual a

> mayor a

≥ mayor o igual a

B.1.1.3 Principio

El método descrito es un procedimiento mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA). Este método se

basa en un sistema de placas de microtitulación de 96 pozos, en estos pozos, las microcistinas y nodularinas

presentes en la muestra y proteína análoga de microcistina inmovilizada en los pozos, compiten por los sitios

de unión de un anticuerpo de detección primaria en solución.

Después de una etapa de lavado, se añade un conjugado enzimático a los p ozos y se une al anticuerpo

primario en una relación inversa con la concentración original de microcistinas y nodularinas en la muestra.

Después de un segundo paso de lavado, se añade substrato de tetrametilbenzidina para desarrollar color a

través de una reacción enzimática.

Tras un período establecido, se añade una solución ácida a cada pozo para detener la generación de

color. Finalmente, la absorbancia de cada pozo se mide utilizando un lector de placas y la concentración de

microcistinas y nodularinas se calcula utilizando una curva de calibración logística de cuatro parámetros.

B.1.1.4 Alcance y aplicación

El método descrito es un procedimiento para la determinación de microcistinas (MC) y nodularinas (NOD)

"totales" en agua de uso y consumo humano (an tes y después del tratamiento). El término "microcistinas y

nodularinas totales" se define como la suma de todos los congéneres independientes, tanto de microcistinas

intracelulares y extracelulares, como de nodularinas que es medible en una muestra. Este método determina

la concentración total basada en la detección de una característica común a los congéneres (variantes

estructurales) de microcistina y nodularina, específicamente la cadena lateral de aminoácidos Adda: Ácido

(4E, 6E) -3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-fenildeca-4,6-dienoico (Fischer et al., 2001). Con la finalidad de

asegurar la comparabilidad entre los laboratorios, el ELISA se calibra contra el congénere Microcistina -LR

(MC-LR) (CASRN 101043-37-2).

B.1.1.5 Equipos y materiales

Las referencias a marcas específicas y números de catálogo se incluyen sólo como ejemplos y no implican

aprobación de los productos. Dicha referencia no excluye el uso de otros proveedores o fabricantes. Las

referencias específicas pretenden representar especificaciones adecuadas para los artículos.

Contenedores de muestras. Botellas de vidrio ámbar con tapas con rosca de politetrafluoroetileno

(PTFE). Se recomienda el uso de contenedores de muestras. Si se reutilizan contenedores de muestra deben

de llevarse a cabo buenas prácticas de laboratorio para la limpieza. No deben utilizarse botellas tratadas a alta

temperatura en un horno de mufla (400 °C y superiores) como procedimiento de limpieza. Los estudios

existentes indican una tendencia a que las microcistinas y las nodularinas se adsorben en la superficie de la

cristalería limpiada repetidamente por calentamiento en un horno de mufla.

Cubiertas de placas adhesivas. Película adhesiva transparente para sellar los pozos durante las etapas

de incubación del ensayo (VWR no. 60941-120).

Filtros de jeringa para filtrado de muestras después de la lisis . Pueden utilizarse filtros de fibra de

vidrio de 25mm, con un tamaño de poro de 1.2µm y carcasa de polipropileno (Environmental Express no.

SF012G) o filtros de fibra de vidri o de 25 mm, con un tamaño de poro de 0.45µm y carcasa de polipropileno

(GE Healthcare Life Sciences/Whatman no. 6894-2504).

Jeringas para filtrado de muestras después de la lisis. Pueden utilizarse jeringas de cristal con cerrado

Luer-lock que no permita e l paso de aire, de 5mL de capacidad (Hamilton Co. no. 1005TLL) o jeringas de

plástico con cerrado Luer -lock que no permita el paso de aire, con una capacidad de 3 mL y cilindros de

polietileno y émbolos de polipropileno (Thermo Fisher Scientific, Inc. no. S7515-3).

Kit de prueba de ELISA Adda. Ensayo competitivo indirecto basado en la detección del epítopo Adda

(Abraxis no. 520011OH o equivalente). Pueden usarse sistemas automatizados para procesar la placa de 96

pozos.

Lector de Placas. Lector de placas de microtitulación y software asociado con la capacidad de determinar

la absorbancia a 450 nm y construir una curva de calibración utilizando una función logística de cuatro

parámetros.

Pipeta de repetición. Pipeta electrónica de repetición HandyStep

con pu ntas desechables de 5 ml

(Wertheim, Alemania). Se recomienda una pipeta electrónica de repetición para la adición del anticuerpo a los

pozos, el conjugado enzimático, el sustrato y la solución de paro.

Pipeta multicanal. Pipeta de ocho canales con 250µL de capacidad por canal y puntas de pipeta de

polipropileno. Se recomienda para la adición a los pozos de la solución de lavado.

Pipeta para carga de pozos. Pipetas manuales ajustables o de volumen fijo con capacidad de 50µL y

puntas de pipeta recomendadas po r el fabricante. Se recomienda para la adición a los pozos de los

estándares, las muestras de campo y las muestras de control de calidad.

Recipiente para la solución de lavado. Recipiente de plástico diseñado para pipetas multicanal (VWR

no. 21007-970). Se recomienda que tenga una capacidad de 55 mL.

Viales de cuatro mililitros. Pueden utilizarse viales de vidrio de borosilicato, con tapas que contengan

empaques de PTFE. Se recomiendan para colocar y almacenar el filtrado de la muestra después de la lisis.

Viales de quince a cuarenta mililitros. Los viales utilizados deben de ser de vidrio de borosilicato,

transparentes o ámbar, con tapas con empaques de PTFE. Se recomiendan viales con capacidad en este

rango para el procedimiento de lisis. No deben utiliza rse botellas tratadas en un horno de mufla a alta

temperatura como procedimiento de limpieza.

B.1.1.6 Reactivos y soluciones

Agente reductor de cloro residual . El tiosulfato de sodio (no. CAS 7772 -98-7) se utiliza para reducir el

cloro residual en las muestras de agua potable en el momento de la recolección.

Estándares de calibración . Se recomienda el uso de los estándares de calibración suministrados en los

kits ELISA. Se permiten los estándares de calibración preparados en el laboratorio. Los laboratorios deben

utilizar prácticas apropiadas de control de calidad para determinar cuándo deben reemplazarse los

estándares.

Solvente regular y para PDS . El metanol (no. CAS 67 -56-1) o el indicado por el fabricante; se usa para

reconstituir MC -LR si este material se adquiere como un sólido, y para diluir el material de MC -LR para

preparar soluciones PDS.

Soluciones y PDS de MC -LR. Se recomienda obtener la MC -LR (no. CAS 101043 -37-2) como una

solución con una concentración de al menos 10 µg/mL o como el material pur o. En caso de que sea como

material puro, este debe de reconstituirse en metanol para obtener una solución con una concentración de al

menos 10 µg/mL. Esta solución de MC -LR debe diluirse con metanol para preparar soluciones PDS. Las

concentraciones de MC-LR para soluciones PDS deben de ser seleccionadas de tal manera que al menos se

utilicen 5µL para fortificar muestras de control de calidad o para preparar estándares de calibración. Más de

una concentración de solución PDS puede ser necesaria para cumplir con este requisito.

B.1.1.7 Procedimiento

B.1.1.7.1 Recolección, conservación y almacenamiento de muestras

Antes del salir a colectar las muestras, debe agregarse tiosulfato de sodio a cada botella de muestra; para

lo cual deberá colocar en el material de muestreo, previo a la esterilización 0.1 mL de solución de tiosulfato de

sodio al 10% para neutralizar 120 mL de la muestra o bien 0.4 mL para 480 mL. El tiosulfato de sodio no debe

de diluirse en agua al preparar las botellas para las muestras. El agente reductor debe añadirse a la botella

vacía en forma sólida. En el campo, abra el grifo y deje que el sistema se descargue durante

aproximadamente 5 minutos. Llenar cada botella, teniendo cuidado de no eliminar el tiosulfato de sodio, e

invertir varias veces para mezclar la muestra con el agente reductor.

Colecte suficiente muestra para cumplir con los requisitos de este método. Para el tamaño de la muestra

debe de considerarse un volumen suficiente para preparar las muestras de control de calidad y el volum en

apropiado para el almacenamiento congelado.

No debe utilizarse ácido ascórbico para reducir el cloro en las muestras de agua de uso y consumo

humano. Durante los estudios para evaluar la estabilidad de las microcistinas durante el transporte y el

almacenamiento, se ha descrito que éstas se degradan en presencia de ácido ascórbico.

La adición de tiosulfato de sodio no es necesaria para agua de uso y consumo humano antes del

tratamiento (muestras colectadas antes de la entrada al sistema de tratamiento), s in embargo, puede añadirse

si el laboratorio elige preparar un solo tipo de contenedor de muestra.

Las muestras deben ser refrigeradas durante el envío y no deben exceder los 10 °C durante las primeras

48 horas después de la recolección.

Se debe confirmar que las muestras están por debajo o igual a 10 °C cuando se reciben en el laboratorio.

Una temperatura superior a 10 °C es aceptable en aquellos casos en los que el tiempo de traslado es corto y

las muestras no tienen tiempo suficiente para alcanzar la tem peratura mencionada. En este caso, deben

revisarse las bolsas de hielo en las hieleras de transporte. Si éstas aún permanecen congeladas, las muestras

pueden considerarse válidas. Las muestras deben de ser congeladas al llegar al laboratorio.

Para muestras de agua de uso y consumo humano que ha pasado a través de un sistema de tratamiento,

debe analizarse una muestra de cada hielera de transporte utilizando ensayos comunes para determinar el

cloro libre residual, por ejemplo, la técnica colorimétrica N, N -dietil-p-fenilendiamina (DPD). La concentración

total de cloro debe ser menor que el límite de detección del ensayo. Se puede recoger una muestra duplicada

para llevar a cabo el ensayo de cloro libre residual.

Para el almacenamiento en congelación, deben utilizarse botellas de vidrio de borosilicato, claras o ámbar,

con tapas con empaques de PTFE. Seleccione la capacidad de la botella y el volumen de la muestra para

evitar la ruptura de las botellas durante la congelación. Planee con anticipación para contar con suficiente

volumen para preparar muestras de control de calidad como se requiere en este método.

Las muestras deben de ser analizadas lo antes posible. Las muestras que se colectan y almacenan deben

analizarse dentro de los 14 días posteriores a la re colección. Este periodo de 14 días se estableció como un

tiempo de retención seguro basado en la evidencia empírica: durante el desarrollo del método, se observó la

degradación de microcistinas en dos matrices de agua potable después de tres semanas de alm acenamiento

en congelación.

Las muestras pueden filtrarse y analizarse en cualquier momento después de lisis, dentro de los 14 días

posteriores a la recolección. Si no se analizan inmediatamente, las muestras lisadas pueden almacenarse

mediante congelación en viales de vidrio con tapas con empaques de PTFE, por ejemplo, 1 ml de muestra

lisada y filtrada contenida en un vial de 4 ml.

B.1.1.7.2 Procedimiento analítico

Este apartado describe el procedimiento para preparar las muestras y procesar la placa de mi crotitulación

para realizar el ELISA. Fortifique las muestras QC antes de la etapa de lisis (LFB, LFSM y LFSMD). Si las

muestras se congelaron, es aceptable fortificar después de este primer ciclo de lisis.

Mezclar completamente e inmediatamente transferir 5 a 10 mL de cada muestra de campo en un vial de

40 mL para comenzar tres ciclos de congelación -descongelación. Si la muestra se congeló previamente, sólo

se necesitan dos ciclos de congelación-descongelación. Pueden utilizarse viales más pequeños, pero r eduzca

el volumen de la muestra a menos del 25% de la capacidad del vial. Asegúrese de que las muestras estén

completamente congeladas y completamente descongeladas durante cada ciclo. Descongelar las muestras a

aproximadamente 35 °C en un baño de agua y mezclar después de cada ciclo.

Filtrar 1 a 2 mL de cada muestra lisada en un vial de 4 mL usando un filtro de jeringa de fibra de vidrio.

Para realizar el ELISA siga las instrucciones del fabricante para agregar muestras y reactivos a la placa.

Llene dos po zos con cada estándar de calibración, muestra de campo y muestra de control de calidad. Al

construir el lote de análisis debe asegurarse de que se incluyen todos los elementos de control de calidad

requeridos. Las muestras de agua de uso y consumo humano p ueden ser procesadas en el mismo lote de

análisis.

Para el desarrollo del color, si se procesan las placas manualmente, utilice una técnica que asegure que

cada pozo se incube con sustrato exactamente durante el mismo período. Para lograr esto, añadir sol ución de

paro en la misma secuencia y al mismo ritmo que la adición de sustrato.

Medir el color leyendo la absorbancia a 450 nanómetros usando un lector de placas de microtitulación.

B.1.1.7.3 Análisis de datos y cálculos

Se debe utilizar un ajuste de curva logística de cuatro parámetros. No se permiten otros modelos de ajuste

de curvas. Calcular la concentración de la muestra para cada pozo utilizando la calibración multipunto. Para

cada campo y muestra QC, debe promediarse los dos valores de concentración de cada pozo. Utilice esta

promedio para reportar los resultados de las muestras y para evaluar los resultados del control de calidad

frente a los límites de aceptación. Reporte solamente los valores que están entre el MRL y el estándar de

calibración más alto. Los resultados finales se redondearán a dos cifras significativas.

Si un resultado excede el rango de la curva de calibración, diluya la muestra con agua grado reactivo.

Basándose en la concentración estimada, seleccione un factor de dilución que re sulte en una concentración

de muestra diluida cerca de la EC 50 de la curva de calibración. La concentración en la muestra diluida debe

situarse entre el MRL y el estándar de calibración más alto. Analizar la muestra diluida en un lote de análisis

posterior. Incorporar el factor de dilución en los cálculos de la concentración final. Informe el factor de dilución

con el resultado de la muestra.

B.1.1.7.4 Informe de prueba

Reportar microcistinas y nodularinas totales como Ausente o Presente.

En caso de que el resultado sea ausencia de microcistinas o nodularinas totales no será necesario llevar a

cabo ningún método confirmatorio adicional.

En caso de que el resultado sea presencia de microcistinas o nodularinas totales deberá de llevarse a

cabo alguno de los do s métodos cuantitativos confirmatorios contenidos en los puntos B.1.2 y B.1.3 de este

Apéndice.

B.1.1.8 Control de calidad, calibración e interferencias

B.1.1.8.1 Control de calidad (QC)

Los requisitos de control de calidad incluyen los elementos IDC y QC asociados con cada lote de análisis.

Este apartado describe cada parámetro QC, su frecuencia requerida y los criterios de desempeño que

deben cumplirse para satisfacer los objetivos de calidad de datos. Estos requisitos de QC se consideran como

lo mínimo a ceptable en un protocolo de calidad. Sin embargo, los laboratorios pueden establecer prácticas

adicionales de control de calidad para satisfacer sus necesidades específicas.

El IDC debe llevarse a cabo antes de analizar las muestras de campo. El IDC incluy e cuatro

determinaciones: demostración de exactitud y precisión, demostración de la presencia de interferencias en el

sistema, confirmación de MRL y una verificación de segunda fuente de los estándares de calibración (muestra

de control de calidad). Los requisitos de IDC se describen en la Tabla B.1.1-1 de este Apéndice.

Tabla B.1.1-1. Requisitos de control de calidad de la demostración inicial de capacidad (IDC)

Requisito Especificación Criterio de aceptación

Demostración de

exactitud y precisión

Lisar y analizar 7 réplicas de blancos

fortificados de laboratorio (LFB) a

0.50µg/L

Porcentaje de desviación estándar

relativa ≤15%. Porcentaje promedio

de recuperación ≥70% y ≤130%

Demostración de la

presencia de

interferencias en el

sistema

Lisar y analizar 5 blancos de reactivo

de laboratorio (LRB) distribuidos a lo

largo de la placa.

La concentración de MC debe ser

menor que la mitad del Nivel mínimo

reportado (MRL) en cada LRB

Confirmación de MRL Fortificar y analizar 7 LFB replicados a

la concentración de MRL propuesta.

Confirmar que el límite superior e

inferior del intervalo de predicción de

resultados (PIR) cumpla con los

criterios de recuperación.

Límite superior PIR ≤150%

Límite interior PIR ≥50%

Verificación de segunda

fuente de los estándares

de calibración (muestra de

control de calidad).

Prepare un QCS cerca de la EC50 con

MC-LR de una fuente independiente de

los estándares de calibración.

Porcentaje de recuperación ≥70% y

≤130% del valor real

Al realizar el IDC, el analista debe cumplir con los requisitos de calibración especificados en el apartado

correspondiente. El estándar de calibración más bajo utilizado para establecer la calibración inicial debe ser

igual o inferior a la concentración que representa el MRL. Las cuatro determinaciones necesarias para

completar el IDC pueden incluirse en un lote de análisis único, es decir, procesarse en una única placa de

ELISA.

Para la demostración de exactitud y precisió n, deben prepararse siete LFB repetidos fortificando cada uno

con 0.50µg/L de MC-LR. Se debe añadir tiosulfato de sodio. Lisar, filtrar y analizar los LFB en un solo lote de

análisis. Para este lote de análisis, se deben de incluir los LRB para cumplir con el requisito QC de LRB.

También se requiere un LOW -CV. El porcentaje de desviación estándar relativa (%RSD) para MC -LR en las

siete repeticiones de LFB debe ser menor o igual a 15%. La recuperación media de las siete repeticiones

debe ser mayor o igual que 70% e inferior o igual a 130%.

Para la demostración de la presencia de interferencias en el sistema, en el mismo lote de análisis llevado a

cabo para la exactitud y precisión en la IDC, lisar, filtrar y analizar cinco LRB. Los LRB deben contener

tiosulfato de sodio. Los LRB deben distribuirse a lo largo de toda la placa. El resultado obtenido para cada

LRB debe ser inferior a la media del MRL.

Para la confirmación del MRL, se debe establecer una concentración objetivo para el MRL en función del

uso destinado del método. Confirme el MRL siguiendo el procedimiento descrito a continuación:

Preparar y analizar muestras de MRL - Fortifique siete LFB replicados con MC -LR en, o por debajo, la

concentración de MRL propuesta. Los LFB deben contener tiosulfato d e sodio como se especifica. Lisar,

filtrar, y analizar las muestras en un lote de análisis único. El lote de análisis debe incluir dos LRB y un LOW-

CV.

Calcular las estadísticas del MRL - Calcular la media y la desviación estándar de las siete réplicas.

Determinar el intervalo medio para el intervalo de predicción de resultados (HRPIR) usando la siguiente

ecuación:

En donde:

s desviación estándar

3.963 valor constante para 7 réplicas

Calcular los límites superiores e inferiores para el intervalo de predic ción de resultados

(PIR=promedio±HRPIR) como se muestra a continuación:

Estas ecuaciones se definen sólo para siete muestras repetidas.

Para los criterios de aceptación de MRL, se confirma el MRL si el límite superior del PIR es menor o igual

a 150% y el límite inferior del PIR es mayor o igual al 50%. Si estos criterios no se cumplen, el MRL puede

establecerse demasiado bajo y la confirmación debe repetirse, o se debe establecer y confirmar el MRL a una

concentración más alta.

Para las QCS, debe analiz arse una QCS de nivel medio, para confirmar la exactitud de los estándares de

calibración primaria.

Los elementos QC que deben incluirse en cada lote de análisis. Los requisitos de lotes de análisis de QC

se resumen en la Tabla B.1.1-2, de este Apéndice.

Tabla B.1.1-2. Requisitos del lote de análisis de QC

Requisito Especificación y frecuencia Criterio de aceptación

Calibración de ELISA Use los niveles y concentraciones

recomendados por el kit. Dos pozos

réplica por estándar.

%CV de absorbancia ≤10%; ≤15%

permitido para un par.

r2 ≥0.98

Pozos réplica Muestra de campo y de control de

calidad en dos pozos.

Muestra no valida si el %CV de los

valores de absorbancia >15%

Blanco de reactivos de

laboratorio (LRB)

Lisar un LRB por lote de análisis.

Analizar en duplicado en lados opuestos

de la placa.

La concentración de MC/NOD

debe ser menor que la mitad del

MRL en cada LRB.

Estándar de verificación de

calibración de bajo alcance

(LOW-CV)

Estándar de calibración en la

concentración de MRL o por debajo de

la misma. Se debe de tener uno por

cada lote de análisis.

Porcentaje de recuperación ≥50%

y ≤150% del valor verdadero.

Blanco fortificado de

laboratorio (LFB)

Agua grado reactivo fortificada cerca de

la EC50 Lisar y analizar dos por lote de

análisis.

Porcentaje de recuperación para

cada LFM ≥60% y ≤140% del valor

verdadero.

Matriz de muestra

fortificada en laboratorio

(LFSM) y duplicado de

LFSM (LFSMD)

Fortifique cerca de la EC50 y al doble de

la concentración nativa. Un conjunto en

lotes de análisis que contienen agua

potable de uso y consumo humano y

dos si son 20 o más muestras de

campo. Un conjunto en Lotes de análisis

que contienen agua colectada antes de

la entrada al sistema de tratamiento y

dos si son 20 o más muestras de

campo.

Porcentaje promedio de

recuperación del par de LFSM y

LFSMD ≥60% y ≤140%. Diferencia

porcentual relativa (RPD) ≤40%.

Calificar los resultados de

muestras que no cumplen estos

límites como "matriz sospechosa".

Muestra de control de

calidad (QCS)

Analizar 1 QCS para cada nuevo lote de

estándares de calibración. Preparar el

QCS cerca de la EC50 con MC-LR de

una fuente independiente de los

estándares de calibración.

Porcentaje de recuperación ≥70%

y ≤130% del valor verdadero.

Todas las muestras de campo y de QC deben añadirse a por lo menos dos pozos (pozos réplica). El %CV

de los valores de absorbancia determinados para los pozos réplica debe ser menor o igual a 15%. Calcular el

% CV como sigue:

Si el %CV excede 15% de la muestra de campo o la muestra de QC (LOW -CV, LRB, LFB, LFSM y

LFSMD), entonces la muestra no se considera válida. Note que los pozos réplica de los estándares de

calibración deben cumplir un conjunto de criterios diferentes para %CV.

Para cada lote de análisis, preparar, lisar y filtrar un Blanco de reactivo de laboratorio (LRB). El LRB debe

contener tiosulfato de sodio si muestras de agua potable se incluyen en el lote de análisis. Analizar el LRB por

duplicado colocando un par de pozos réplica en lados opuestos de la placa (cuatro pozos totales). La

concentración total de microcistina y nodularin a en cada LRB debe ser inferior a la mitad del MRL. Si la

concentración es igual o mayor que este nivel, entonces cualquier muestra con un resultado positivo en el lote

de análisis no se considera válida. No se permite restar valores del blanco de los resultados de la muestra.

Con cada lote de análisis, debe analizarse un estándar de verificación de calibración de bajo alcance

(LOW-CV). El LOW-CV es un estándar de calibración preparado a una concentración igual o inferior al MRL.

Puede utilizarse un estánda r de calibración del kit. No debe añadirse tiosulfato de sodio, no lisar y no filtrar el

LOW-CV. La concentración analizada en el LOW -CV debe ser mayor o igual al 50% y menor o igual al 150%

del valor real. Si el resultado no cumple este criterio, entonces todo el lote de análisis no es válido.

Se requieren al menos dos blancos fortificados de laboratorio (LFB), a una concentración idéntica, con

cada lote de análisis. Añadir tiosulfato de sodio si muestras de agua potable se incluyen en el lote de análisis.

Fortificar el LFB cerca de la EC50 de la curva de calibración. Lisar y filtrar cada LFB en un vial por separado.

Como criterio de aceptación para el LFB, el porcentaje de recuperación para cada LFB debe ser mayor o

igual a 60% y menor o igual a 140% del v alor real. Si el LFB no cumple este criterio, entonces todo el lote de

análisis no se considera válido.

Se requiere un conjunto de matriz de muestra fortificada en laboratorio (LFSM) y duplicado de la matriz de

muestra fortificada en laboratorio (LFSMD) co n cada lote de análisis en una muestra de agua de uso y

consumo humano, sin embargo, si más de 20 muestras de agua están presentes en el lote de análisis,

entonces se requieren dos conjuntos. De la misma manera, se requiere un conjunto LFSM y LFSMD con cad a

lote de análisis en una muestra de agua antes de la entrada al sistema de tratamiento, sin embargo, si hay

más de 20 muestras de agua en el lote de análisis, entonces se requieren dos conjuntos. La concentración

nativa en la muestra debe determinarse en una muestra de campo de manera independiente. En la rutina de

trabajo, distribuya los LFSM entre las diversas fuentes de agua de uso y consumo humano (antes y después

del tratamiento).

Se requieren tres alícuotas separadas de una muestra de campo para determinar la concentración nativa y

para preparar el LFSM y el LFSMD. Preparar el LFSM y LFSMD fortificando dos alícuotas de la misma

muestra de campo con una cantidad apropiada de MC -LR. Si está congelado, descongelar las muestras.

Mezclar bien para homogene izar la muestra antes de distribuir en los tres viales. Elija una concentración tal

que el resultado de la microcistina total y la nodularina se encuentre cerca de la EC 50 de la curva de

calibración y fortifique al menos el doble de la concentración nativa , si se conoce. Lisar y filtrar las muestras, o

si las muestras fueron congeladas, completar dos ciclos más de lisis.

Si no se conoce la concentración en este tipo de muestras de agua, seleccione aleatoriamente las

muestras y fortifique con aproximadamente 1.0µg/L de MC -LR. Si la concentración inicial en los LFSM

seleccionados al azar es alta, el resultado de la muestra fortificada puede caer fuera del intervalo de la

calibración de ELISA, o fallar en cumplir el requisito de fortificar a una concentración a l menos dos veces del

valor nativo. En estos casos, los resultados del control de calidad se consideran inutilizables y pueden

descartarse. Sin embargo, el laboratorio debe intentar recolectar datos válidos de LFSM con el tiempo para

este tipo de muestras de agua.

Cálculo del porcentaje promedio de recuperación - Calcular el porcentaje promedio de recuperación (%R)

para cada conjunto de LFSM y LFSMD utilizando la siguiente ecuación:

En donde:

A concentración determinada promedio del LFSM y LFSMD

B concentración determinada en la muestra sin fortificar

C concentración fortificada

Para obtener resultados significativos del porcentaje de recuperación, se debe corregir el valor promedio

del LFSM y LFSMD para la concentración nativa en la muestra no fortificada , incluso si el valor nativo es

menor que el MRL.

El porcentaje promedio de recuperación para cada conjunto LFSM y LFSMD debe ser mayor o igual al

60% y menor o igual al 140% del valor real. Si el porcentaje de recuperación queda fuera de este intervalo, y

el rendimiento del laboratorio está en control de los LFB dentro del mismo lote de análisis, la recuperación

puede tener un sesgo de matriz. Calificar el resultado para la muestra de la cual se preparó el LFSM como

"matriz sospechosa".

Calcular la diferencia porcentual relativa (RPD) usando la siguiente ecuación:

El RPD para cada conjunto de LFSM y LFSMD debe ser menor o igual al 40%. Si la RPD cae fuera de

este intervalo y el rendimiento del laboratorio está en control de los LFB dentro del mismo Lote d e Análisis, la

precisión puede tener un sesgo de matriz. Calificar el resultado para la muestra de la cual se preparó el

LFSMD como "matriz sospechosa".

Una QCS debe ser analizada durante el IDC y posteriormente con cada nuevo lote de estándares de

calibración. La MC-LR utilizado para el QCS debe obtenerse de una fuente independiente de la fuente de los

estándares de calibración. Preparar el QCS en agua grado reactivo cerca de la EC 50. Se puede utilizar un

QCS suministrado con el kit ELISA si este criterio es conocido. El porcentaje de recuperación de MC -LR en el

QCS debe ser mayor o igual que 70% e inferior o igual a 130%.

B.1.1.8.2 Calibración

Se requiere una calibración con cada lote de análisis. Utilice las concentraciones indicadas en las

instrucciones del kit. No agregue niveles de calibración adicionales ni elimine ningún nivel. Los laboratorios

pueden preparar estándares de calibración, sin embargo, el número de niveles y concentraciones debe

coincidir con los del kit original. Cada estándar de calibr ación debe agregarse en al menos dos pozos. El

estándar de calibración más bajo debe ser igual o inferior a la concentración del MRL.

La curva de calibración se valida evaluando el %CV de los valores de absorbancia para los pozos réplica

que representan ca da nivel de calibración y el coeficiente de correlación de la curva logística de cuatro

parámetros. Calcular el %CV para cada uno de los valores de absorbancia pareados, incluido el estándar

"cero". El %CV para cada par debe ser menor o igual al 10%. Sin e mbargo, se permite que un par exceda del

10% siempre que el %CV sea menor o igual al 15%. El cuadrado del coeficiente de correlación (r 2) de la curva

de cuatro parámetros debe ser mayor o igual a 0.98.

Si la calibración se encuentra fuera de los límites %C V o el valor r2 es inferior a 0.98, entonces todo el lote

de análisis no se considera válido. Analizar las muestras en un lote de análisis posterior. Congelar las

muestras filtradas si este lote de análisis no se puede completar el mismo día que el ensayo original. Cada

muestra debe estar dentro del tiempo de espera de 14 días para repetir el ensayo.

B.1.1.8.3 Interferencias

La exactitud del procedimiento de ELISA depende de la técnica del analista, la precisión de los volúmenes

pipeteados y períodos de incubación uniformes a través de los pozos de cada placa.

La desviación del ensayo se refiere a la imprecisión sistemática en lugar de la imprecisión al azar en las

concentraciones determinadas del analito de interés, cuya magnitud depende de la posición de l a muestra

dentro de la placa. Una posible causa de la desviación del ensayo son ligeras diferencias en los tiempos de

incubación a medida que se añaden los reactivos secuencialmente a través de la placa (Davies, Chris.

2005.“Concepts” en “The Immunoassay Handbook”, 3rd ed.; Ed. Wild, David; Elsevier, Ltd. Oxford, UK, p 119

(sección titulada “Assay Drift”)). Para detectar la desviación del ensayo es necesario distribuir a través de la

placa muestras de control idénticas. Este método incluye medidas de contro l de calidad para evaluar la

desviación del ensayo. Durante la IDC, los laboratorios deben analizar cinco LRB distribuidos a través de la

placa y cada lote de análisis debe incluir dos LRB colocados en lados opuestos de la placa. Debido a que los

LRB propo rcionan valores de absorbancia cerca de la meseta superior de la curva de calibración, las

concentraciones LRB calculadas son sensibles a ligeros cambios en la absorbancia determinada. Si los LRB

distribuidos pasan el límite de control de calidad en una me dia del valor de MRL, entonces la desviación del

ensayo de la placa es mínima y puede considerarse bajo control.

Considerando que la microcistina puede ser determinada a la entrada del sistema de tratamiento, en

donde el agua puede provenir de una fuente n atural, las muestras de agua colectadas en la entrada del

sistema de tratamiento, para este método, podrían considerarse como muestras ambientales. En ese sentido

es importante observar que durante el desarrollo del método, se ha observado un sesgo positiv o de

aproximadamente el 30% en muestras de agua ambientales de una sola fuente. Dos aguas ambientales de

otras fuentes no causaron sesgo de matriz.

Durante el desarrollo del método, se evaluaron seis fuentes de agua potable para los efectos de la matriz.

De estos, tres mostraron sesgo positivo en un rango de 12 a 15%. Tres fuentes no causaron sesgo de matriz.

Este método contempla el análisis de muestras colectadas tanto de agua para uso y consumo humano

que ha pasado a través de sistema de tratamiento como de muestras de agua colectadas en la entrada del

sistema de tratamiento que provienen de fuentes naturales (muestras ambientales). Con la finalidad de evitar

la contaminación cruzada, es importante separar las jeringas de vidrio utilizadas para filtrar el agua de

muestras ambientales, que puede contener altos niveles de microcistinas, de las usadas para filtrar el agua

potable de uso y consumo humano que ha pasado a través de sistemas de tratamiento. Alternativamente,

pueden utilizarse jeringas de plástico desechables. Es importante limpiar adecuadamente los recipientes de

las muestras que son vidrio en caso de ser reutilizados. No deben de reutilizarse septos de botellas que

contengan muestras de agua ambientales.

Los resultados reportados por este método representan el total de las microcistinas y nodularinas basadas

en el método de ELISA Adda calibrado con MC-LR.

B.1.1.9 Seguridad, prevención de contaminación y manejo de residuos

Cada reactivo utilizado en estos procedimientos debe ser tratado como un rie sgo potencial para la salud y

la exposición a estos materiales debe ser minimizada. Cada laboratorio es responsable de mantener un

conocimiento de las regulaciones respecto a la manipulación segura de cualquier producto químico usado en

este método. Debe p onerse a disposición de todo el personal involucrado en el análisis las hojas de datos de

seguridad de los productos químicos. El riesgo principal cuando se realizan los procedimientos en este

método es la exposición a cianotoxinas en las muestras y en los estándares concentrados. Debe de utilizarse

equipo de protección personal apropiado para el manejo de muestras y estándares.

Para obtener información sobre la prevención de contaminación aplicable a las operaciones de laboratorio

descritas en este método, puede consultar referencias especializadas (p.ej. American Chemical Society,

2002).

Es necesario que el laboratorio cumpla con las regulaciones vigentes y aplicables en materia de manejo

de residuos ante la autoridad correspondiente.

B.1.1.10 Referencias

● American Chemical Society. 2002. “Less is Better, Guide to Minimizing Waste in Laboratories”.

● Davies, Chris. 2005. “Concepts” en “The Immunoassay Handbook”, 3rd ed.; Ed. Wild, David; Elsevier,

Ltd. Oxford, UK, p 119 (sección titulada “Assay Drift”).

● Fischer, Werner J. et al. 2001 Congener-Independent Immunoassay for Microcystins and Nodularins.

Environ. Sci. Technol.35: 4849–4856

● Maciel, Robert J. 1985. Standard Curve Fitting in Immunodiagnostics: a Primer . Journal of Clinical

Immunoassay. Vol. 8, 98–106.

● Ohio EPA Division of Environmental Services. 2015. Ohio EPA Total (Extracellular and Intracellular)

Microcystins – ADDA by ELISA Analytical Methodology; Method 701.0 Version 2.2 (and previous

versions); Ohio EPA: Reynoldsburg, OH.

● Sasaki, Diane and Mitchell, Robert A. 2016. How to Obtain Reproducible Quantitative ELISA Results.

Oxford Biomedical Research website.

● Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 23rd. Edition APHA 2017.

● U.S. EPA. 2004. Statistical Protocol for th e Determination of the Single -Laboratory Lowest

Concentration Minimum Reporting Level (LCMRL) and Validation of Laboratory Performance at or

Below the Minimum Reporting Level (MRL); EPA 815-R-05-006; Office of Water: Cincinnati, OH.

● U.S. EPA. 2010. Technical Basis for the Lowest Concentration Minimum Reporting Level (LCMRL)

Calculator; EPA 815-R-11-001; Office of Water: Cincinnati, OH.

● U.S. EPA. 2016. Determination of total Microcystints and Nodularins in Drinking Water and Ambient

Eater by Adda Enzyme-Linkes Immunosorbent Assay. Method 546.

B.1.2 MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE MICROCISTINAS Y NODULARINAS EN AGUA DE USO

Y CONSUMO HUMANO POR EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA Y CROMATOGRAFÍA

LIQUIDA/ESPECTOMETRÍA DE MASAS EN TÁNDEM (LC/MS/MS)

B.1.2.1 Definiciones y términos

Analito surrogado (SUR), al producto químico puro que se asemeja químicamente a los analitos de

interés y es extremadamente improbable que se encuentre en cualquier muestra. Este producto químico se

añade a una alícuota de muestra en una canti dad o cantidades conocidas antes del procesamiento y se mide

con los mismos procedimientos usados para medir los otros analitos. El propósito del SUR es monitorear el

desempeño del método con cada muestra.

Blanco de reactivo de laboratorio (LRB ), a la alíc uota de agua grado reactivo u otra matriz blanco que

se trata exactamente como una muestra incluyendo la exposición a toda la cristalería, equipo, disolventes y

reactivos, conservantes de muestras y surrogados que se utilizan en el lote de análisis. El LRB se utiliza para

determinar si los analitos de interés u otras interferencias están presentes en el entorno del laboratorio, los

reactivos o los aparatos.

Blanco fortificado de laboratorio (LFB) , al volumen de agua grado reactivo u otra matriz blanco de la

que se conocen cantidades del analito y todos los compuestos se añaden en el laboratorio. El LFB se analiza

exactamente como una muestra y su propósito es determinar tanto si la metodología está en control como si

el laboratorio es capaz de realizar mediciones precisas y exactas.

Concentración más baja del nivel mínimo reportado (LCMRL) , a la concentración más baja verdadera

para la cual se espera una recuperación futura espera entre 50 y 150% de recuperación, con un 99% de

confianza.

Disociación activada por colisiones (CAD) , al proceso de convertir la energía de traslación del ion

precursor en energía interna por colisiones con moléculas de gas neutro para producir la disociación en los

iones del producto.

Duplicados de campo (FD1, FD2) , a las dos muestra s separadas recolectadas al mismo tiempo y el

mismo lugar bajo circunstancias idénticas, y tratadas exactamente igual bajo los mismos procedimientos de

campo y laboratorio. El análisis de FD1 y FD2 dan una medida de la precisión asociada con la recolección ,

conservación y almacenamiento de las muestras, así como de los procedimientos de laboratorio.

duplicado de la matriz de muestra fortificada en laboratorio (LFSMD) , al duplicado de la muestra de

campo utilizada para preparar la LFSM. El LFSMD es fortifica do, extraído y analizados de forma idéntica a la

LFSM. El LFSMD se utiliza en lugar del duplicado de campo para evaluar la precisión del método cuando la

ocurrencia de los analitos es infrecuente.

Estándar de calibración (CAL) , a la solución preparada a pa rtir de la dilución primaria de la solución

estándar y/o solución estándar y el surrogado. Las soluciones CAL se utilizan para calibrar la respuesta del

instrumento con respecto a la concentración del analito de interés.

Hoja de datos de seguridad del mate rial (MSDS) , a la información escrita proporcionada por los

vendedores acerca de la toxicidad del producto químico, los riesgos para la salud, las propiedades físicas,

riesgo de incendio y reactividad, incluyendo las precauciones de almacenamiento, derrame y manipulación.

Ion precursor, a la molécula protonada del analito ([M + H] + o [M + 2H]2+). En MS/MS, el ion precursor es

masa seleccionada y fragmentada por CAD para producir iones producto distintivos de menor relación m/z.

Ion producto, fragmentos de iones producidos en MS/MS por CAD a partir del ion precursor.

Límite de detección (DL), a la concentración mínima de un analito de interés que puede ser Identificado,

medido y reportado con un 99% de confianza de que la concentración del analito es mayor a cero. Esta es

una determinación estadística de precisión y no se espera una cuantificación exacta a este nivel.

Lote de análisis, al conjunto de muestras que se analiza en el mismo instrumento durante un período de

24 horas, incluyendo no más de 20 muestra s de campo, que comienza y termina con el análisis de los

estándares de verificación de calibración continua (CCC) apropiados. Pueden requerirse CCC adicionales

dependiendo de la longitud del lote de análisis y/o el número de muestras de campo.

Lote de ext racción, al conjunto de hasta 20 muestras de campo (sin incluir las muestras de Control de

Calidad, QC) extraídas juntas por la misma persona durante un día de trabajo usando el mismo lote de

dispositivos SPE, disolventes, sustitutivos y soluciones para fortificar. Las muestras de QC requeridas incluyen

el blanco de reactivo de laboratorio, el blanco fortificado de laboratorio, la matriz de la muestra fortificada de

laboratorio y un duplicado de campo o duplicado de matriz de la muestra fortificada de laboratorio.

Matriz de muestra fortificada en laboratorio (LFSM) , a la muestra de campo preservada a la que se

añaden en el laboratorio cantidades conocidas de los analitos de interés. La LFSM es procesado y analizado

exactamente como una muestra y su propósito es determinar si la matriz de la muestra contribuye a los

resultados analíticos. Las concentraciones de fondo de los analitos en la matriz de muestra deben ser

determinadas en una extracción independiente de la muestra y los valores medidos en la LFSM cor regidos

para las concentraciones de fondo.

Muestra de control de calidad (QCS) , a la solución de analitos de concentraciones conocidas que se

obtiene de una fuente externa al laboratorio y diferente del estándar de calibración. La segunda fuente para la

solución estándar se utiliza para fortalecer el QCS a una concentración conocida. El QCS se utiliza para

comprobar la integridad del estándar de calibración.

Nivel mínimo reportado (MRL ), a la concentración mínima que puede ser reportada como un valor

cuantificado para un analito en una muestra después del análisis. Esta concentración definida no puede ser

inferior a la concentración del estándar de calibración más bajo para ese analito y sólo puede utilizarse si se

cumplen los criterios de control de calidad (QC) aceptables para ese estándar.

Solución estándar (SSS ), a la solución concentrada que contiene uno o más analitos preparada en el

laboratorio utilizando materiales de referencia ensayados o adquiridos de una fuente comercial de buena

reputación.

Solución estándar de dilución primaria (PDS ), a la solución que contiene los analitos preparados en el

laboratorio a partir de soluciones estándar y diluida según sea necesario para preparar soluciones de

calibración y otras soluciones de analito necesarias.

Verificación de calibración continua (CCC) , al estándar de calibración que contiene los analitos del

método y surrogados. El CCC se analiza periódicamente para verificar la exactitud de la calibración existente

para esos analitos.

B.1.2.2 Símbolos y términos abreviados

CAD disociación activada por colisiones

CAL estándar de calibración

CCC verificación de calibración continua

C2D5-MC-LR microcistina LR etilada, d5

DL límite de detección

ESI Ionización por electrospray

FD1, FD2 duplicados de campo

LCMRL concentración más baja del nivel mínimo reportado

LFB blanco fortificado de laboratorio

LRB blanco de reactivo de laboratorio

LFSM Matriz de muestra fortificada en laboratorio

LFSMD duplicado de la matriz de muestra fortificada en laboratorio

MC-LR microcistina-LR

mL/min mililitro/minuto

[M + H]+ Primer estado de protonación del analito

[M + 2H]2+ Segundo estado de protonación del analito

MRL nivel mínimo reportado

MSDS hoja de datos de seguridad del material

PDS solución estándar de dilución primaria

QC control de calidad

QCS muestra de control de calidad

RSD desviación estándar relativa

SPE extracción en fase sólida

SSS solución estándar

SUR analito surrogado

± más y menos

B.1.2.3 Principio

Una muestra de agua de 500 ml (fortificada con un surrogado) se filtra y se colectan tanto el filtrado como

el filtro. El filtro se coloca en una solución de metanol que contiene 20% de agua grado reactivo y se mantiene

durante al menos una hora a -20 ºC para liberar las toxinas intracelulares de las célula de cianobacterias

capturadas en el filtro. El líquido se extrae del filtro y es añadido al filtrado acuoso de 500mL. La muestra de

500 ml (más la solución de toxina intracelular) es pasa a través de un cartucho de SPE para extraer los

analitos de interés y el surrogado. Los analitos se eluyen de la fase sólida con una pequeña cantidad de

metanol que contiene un 10% de agua grado reactivo. El extracto es concentrado a sequedad por evaporación

con nitrógeno en un baño de agua caliente y luego se ajusta a un volumen de 1 ml con metanol que contiene

un 10% de agua grado reactivo. Se hace una inyección de 10 µL en una LC equipada con una columna C 8

interconectada a un MS/MS. Los analitos se separan e identifican comparando los espectros de masas y los

tiempos de retención con los espectros de referencia y los tiempos de retención de los estándares de

calibración realizados bajo condiciones idénticas de LC/MS/MS. La concentración de cada analito de interés

se determina mediante calibración estándar externa.

B.1.2.4 Alcance y aplicación

Este es un método de cromatografía l íquida/espectrometría de masas en tándem (LC/MS/MS) para la

determinación de microcistinas y nodularinas (combinado intracelular y extracelular) en agua de uso y

consumo humano.

Los datos de exactitud y precisión han sido generados en agua grado reactivo y finalizados en aguas

subterráneas y superficiales terminadas para los analitos listados en la Tabla B.1.2-1, de este Apéndice.

Tabla B.1.2-1. Analitos que pueden ser determinados por este método

Analito Número CAS

Microcistina-La (MC-LA) 96180-79-9

Microcistina-LFA (MC-LF) 154037-70-4

Microcistina-LR (MC-LR) 101043-37-2

Microcistina-LY (MC-LY) 123304-10-9

Microcistina-RR (MC-RR) 111755-37-4

Microcistina-YR (MC-YR) 101064-48-6

Nodularina-R (NOD-R) 118399-22-7

Este método debe de ser utilizado por analistas expertos en extracciones en fase sólida, funcionamiento

de los instrumentos de LC/MS/MS y la interpretación de los datos asociados.

En reconocimiento de los avances tecnológicos en sistemas y técnicas analít icas, se permite al laboratorio

modificar las técnicas de evaporación, separación, columna LC, composición de fase móvil, condiciones LC y

condiciones MS y MS/MS. Sin embargo, no deben de realizarse cambios a la recolección y conservación de

muestras, a las etapas de extracción de muestras, ni a los requisitos de control de calidad. Las modificaciones

deben ser consideradas sólo para mejorar el rendimiento del método. Modificaciones que son introducidas con

el interés de reducir el costo o el tiempo de proc esamiento de la muestra, pero dar lugar a un método más

pobre no deben utilizarse. Los analitos deben estar adecuadamente resueltos cromatográficamente para

permitir que el espectrómetro de masas proporcione un número mínimo de compuestos eluyendo dentro d e

una ventana de tiempo de retención. La sensibilidad instrumental (señal de ruido) disminuirá si se permite que

demasiados compuestos eluyan dentro de una ventana de tiempo de retención. En todos los casos en los que

se proponen modificaciones de del méto do, el analista debe realizar los procedimientos descritos en la

demostración inicial de capacidad (IDC), verificar que conoce todos los criterios de aceptación del control de

calidad (QC) y que el rendimiento del método aceptable puede verificarse en una matriz de muestra real.

B.1.2.5 Equipos y materiales

Las referencias a marcas específicas y números de catálogo se incluyen sólo como ejemplos y no implican

aprobación de los productos. Dicha referencia no excluye el uso de otros proveedores o fabricantes. Las

referencias específicas pretenden representar especificaciones adecuadas para los artículos.

Abrazadera metálica. Abrazadera de aluminio de 47 mm (Kimble Chase #953753-0000 o equivalente).

Balanza analítica. Balanza analítica capaz de pesar 0. 000 1 g

Base de filtro O-ring. Anillo de sellado de PTFE /silicona (Kimble Chase # 410171-4226 o equivalente).

Base de soporte. Base de soporte para filtración de vidrio fritado de 47 mm (Kimble Chase # 953752-

5047 o equivalente).

Boquilla para manguera. Adaptador de tubo para aparatos de filtración (Kimble Chase #736400 -1413 o

equivalente).

Cartuchos para dispositivo de SPE. Waters Oasis HLB, 150 mg, 6cc copolí mero divinilbenceno N-

vinilpirrolidona (Waters # 186003365).

Contenedores de muestra . Botellas de vidrio ámbar de 500 mL con tapa con rosca de

politetrafluoroetileno (PTFE).

Columna analítica. Columna LC C 8 (2.1x100mm) cargada con partículas de fase sólida C 8 de 2.6µm

(Phenomenex Kinetex # 00D -4497-A