Apéndice A — NOM-199-SSA1-2000, Salud ambiental. Niveles de plomo en sangre y acciones como criterios para proteger la salud de la población expuesta no ocupacionalmente.

APENDICE A

METODOS DE PRUEBA PARA LA DETERMINACION DE PLOMO EN SANGRE

ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION ATOMICA CON HORNO DE GRAFITO, CORRECTOR

DE FONDO, MODIFICADOR DE MATRIZ Y PLATAFORMA DE L´VOV; Y VOLTAMPEROMETRIA

DE REDISOLUCION ANODICA

1. Toma de la muestra

Para que los resultados de las determinaciones de plomo en sangre sean confiables, la colección y el

manejo de muestras son factores importantes que hay que controlar adecuadamente, por lo que la muestra

debe ser colectada por punción venosa en un lugar cerrado fuera del área de exposición y con las

condiciones de higiene adecuadas para evitar la contaminación de la misma.

La sangre humana se debe manejar cuidadosamente considerándola como fuente potencial de

enfermedades infectocontagiosas (hepatitis, SIDA, entre otras, por lo cual se deben cumplir las medidas

de seguridad e higiene para el manejo y disposición de materiales, sustancias y residuos biológico,

infecciosos (NOM-087-ECOL-1994).

1.1 Material requerido:

Todo el material utilizado en el desarrollo de este método debe ser exclusivo para esta finalidad

y no debe ser empleado para otras determinaciones, para disminuir la probabilidad de contaminación por

fuentes externas.

1.1.1 Tubos libres de plomo de 1 ml de capacidad con anticoagulante (para niños menores de 1 año).

1.1.2 Tubos de extracción de sangre al vacío de 3 a 10 ml de capacidad, que contengan anticoagulante.

1.1.3 Anticoagulantes en polvo: K

3EDTA (EDTA al 15%/ml de sangre), Na 2EDTA (1.5 mg de EDTA/ml de

sangre), heparina sódica o de litio (143 unidades USP).

Se recomienda usar EDTA-Tripotásico y disódico debido a que la heparina permite la formación de

microcoágulos en muestras almacenadas.

Si la persona sujeta a análisis está bajo tratamiento farmacológico con agentes quelantes, se debe

obtener la muestra cinco días después de haber tomado la última dosis.

Unicamente para el método de prueba de voltamperometría de redisolución anódica . En caso de utilizar

material con EDTA, se requiere que el tubo sea llenado por lo menos a dos tercios de su capacidad al tomar

la muestra, para que la concentración del anticoagulante sea la indicada.

1.1.4 Agujas estériles para toma múltiple

1.1.5 Adaptador o sujetador de plástico para los tubos al vacío.

1.1.6 Torniquete o liga de hule flexible.

1.1.7 Torundas de algodón.

1.1.8 Alcohol etílico 96º.

1.1.9 Producto limpiador dermatológicamente probado con eficiencia demostrada para eliminar plomo

en piel.

1.1.10 Recipiente adecuado para el desecho de material con residuos peligrosos, biológico-infecciosos

(NOM-087-ECOL-1994).

1.1.11 Recipientes, contenedores térmicos o hieleras con refrigerantes en su interior

1.1.12 Etiquetas adhesivas

1.1.13 Charola de plástico o acero inoxidable

1.1.14 Palangana de plástico o acero inoxidable

1.1.15 Gasas estériles

1.1.16 Guantes desechables

1.1.17 Paño de lino estéril

1.1.18 Alcohol isopropílico

1.2 Procedimiento:

1.2.1 Para sangre venosa

1.2.1.1 Lavar perfectamente el sitio de la toma de la muestra (brazo, antebrazo, talón, cara anterior de la

muñeca y el área de punción) con agua y algún producto limpiador dermatológicamente probado, que

arrastre el plomo, enjuagando con agua desionizada y dejar secar.

1.2.1.2 Etiquetar e identificar con tinta indeleble cada tubo para la toma de las muestras al menos con la

siguiente información: a) nombre de la persona y b) número de clave o código asignado por el laboratorio.

1.2.1.3 Realizar la punción venosa y tomar la muestra. Obtener al menos 2 ml de sangre en el caso de

personas mayores de 1 año y 1 ml en niños menores de un año. Para el método de voltamperometría

de redisolución anódica se debe colectar la sangre al menos hasta dos tercios de la capacidad del tubo al

tomar la muestra.

1.2.1.4 Agitar suavemente por inversión el tubo donde se colectó la muestra, mínimo 20 veces, para

mezclar el anticoagulante.

1.2.2 Para cordón umbilical.

1.2.2.1 La toma de la muestra en cordón umbilical debe realizarse en los primeros 30 minutos después

del parto.

1.2.2.2 Utilice una charola preparada y reciba la placenta en una palangana del equipo de obstetricia.

1.2.2.3 Extienda el cordón sobre el borde de la palangana con la pinza de la charola. Limpie con gasas

cualquier líquido que exista en el cordón, desde el punto de unión a la placenta, hasta el punto que cuelga

sobre el borde de la palangana.

1.2.2.4 Coloque un paño de lino estéril bajo el cordón, de tal manera que quede situado bajo todo el

cordón umbilical que descansa sobre la palangana.

1.2.2.5 Frote en una sola dirección, del punto de unión de la placenta al borde de la palangana, el cordón

umbilical con una torunda de alcohol isopropílico. Repita este procedimiento con una segunda torunda.

1.2.2.6 Posteriormente enjuague el cordón umbilical con 10 ml de agua desionizada con una jeringa,

teniendo cuidado de rociar del final del cordón (en el borde de la palangana) hacia la placenta.

1.2.2.7 Limpie el exceso de agua con una gasa estéril, asegurándose de limpiar en una sola dirección, del

borde de la palangana hacia la placenta. Cambie de guantes conforme sea necesario.

1.2.2.8 Etiquetar e identificar con tinta indeleble cada tubo al vacío para la toma de las muestras al menos

con la siguiente información: a) nombre de la madre del niño, b) especificar que es sangre del cordón

umbilical del producto y c) número de clave o código asignado por el laboratorio.

1.2.2.9 Realizar la punción utilizando el contenedor del tubo al vacío, inserte una aguja del número 20 en

la parte limpia del cordón umbilical. Posteriormente inserte el tubo al vacío y obtenga al menos ¾ partes de

sangre de la capacidad del tubo al vacío al tomar la muestra.

1.2.2.10 Agite suavemente 20 veces el tubo al vacío, permitiendo que el anticoagulante se mezcle

con la sangre.

1.2.2.11 Método de prueba para la Determinación de Plomo en Sangre.

1.3 Manejo, Transporte y Almacenamiento:

Cuando las muestras de sangre sean transportadas al laboratorio para su análisis, se deben tener en

cuenta las precauciones siguientes:

1.3.1 Si el tiempo utilizado para su transporte es menor a seis horas deben mantenerse en un intervalo de

temperatura de 4 a 25ºC, hasta llegar al laboratorio donde serán refrigeradas a una temperatura de 4 a 8ºC

para su conservación.

1.3.2 El análisis de la muestra no será mayor a tres semanas a partir del día de la toma de la muestra.

1.3.3 Si el tiempo utilizado para su transporte es mayor a 6 horas se debe emplear un recipiente térmico

para mantener las muestras a una temperatura de 4 a 8ºC mediante refrigerantes.

1.4 Criterios de rechazo de muestras:

El criterio para el rechazo de muestras es aplicable a:

A) Aquellas cuyo volumen sea menor a 2 ml en el caso de personas mayores de un año y 0.50 ml en

niños menores de un año, para espectrofotometría de absorción atómica.

B) En voltamperometría de redisolución anódica, cuando el volumen sea menor de dos tercios de la

capacidad del tubo.

C) Aquellas en las que se sospeche de contaminación debido al manejo inadecuado evidente.

D) Muestras coaguladas.

2. Limpieza del material utilizado para el análisis de las muestras

Todo el material de vidrio, plástico u otro utilizado para el análisis de muestras para la determinación de

plomo en sangre, que se use más de una vez, debe someterse a técnicas específicas de limpieza química

con el fin de evitar alguna contaminación por plomo y polvo proveniente del medio ambiente.

2.1 Equipos, Materiales y Reactivos

2.1.1 Instrumental de vidrio, plástico u otros materiales (pipetas, matraces, vasos de precipitado,

probetas, tapones, tubos de ensaye, botes de polipropileno y recipientes diversos).

2.1.2 Jabón o solución limpiadora catiónica al 2.0%.

2.1.3 Solución de ácido nítrico (HNO3) al 10% grado analítico.

2.1.4 Agua tipo I; ###10.0 M### cm-1.

2.1.5 Estufa para secado de material, ajustada a una temperatura de 70ºC.

2.1.6 Recipientes de vidrio o plástico cuyas dimensiones permitan la limpieza segura del instrumental.

2.1.7 Bolsas de plástico.

2.1.8 Agua corriente.

2.1.9 Guantes resistentes al ácido nítrico al 10%.

2.2 Procedimiento para el lavado

2.2.1 Lavar con agua corriente los implementos e instrumental de vidrio, plástico u otros.

2.2.2 Sumergirlos en una solución de detergente catiónico al 2.0%, al menos durante 2 horas.

2.2.3 Enjuagarlos con agua corriente.

2.2.4 Sumergirlos en una solución que contenga ácido nítrico al 10%, se dejan reposar al menos

12 horas.

2.2.5 Enjuagarlo abundantemente con agua tipo I; ###10.0 M### cm-1.

2.2.6 Secarlos perfectamente dejándolos escurrir o en la estufa a una temperatura de 70ºC por un tiempo

de 2 a 3 horas, a excepción del instrumental calibrado.

2.2.7 Dejarlos enfriar sobre una superficie teniéndolos cubiertos para evitar que se contaminen por

fuentes externas.

2.2.8 Guardarlos en bolsas de plástico para evitar la contaminación de cualquier agente externo.

3. Método de prueba

ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION ATOMICA CON HORNO DE GRAFITO, CORRECTOR DE

FONDO, MUESTREADOR AUTOMATICO, MODIFICADOR DE MATRIZ, PLATAFORMA DE L´VOV.

Método para la determinación de plomo en sangre por espectrofotometría de absorción atómica con

horno de grafito, corrector de fondo y muestreador automático, usando modificador de matriz y plataforma

de L´vov.

Este método es adecuado para evaluar el plomo en sangre que tenga concentraciones de este metal

hasta 80 ###g/dl. Sin embargo, pueden determinarse niveles mayores de plomo cuando se aplican diluciones

a la muestra original.

3.1 Principio del método.

A partir de muestras de sangre y estándares de concentración conocida, se obtienen átomos de plomo en

estado elemental; se hace pasar a través de éstos un haz de luz de 283.3 nm y se mide la cantidad de luz

absorbida, que es proporcional al número de átomos presentes; para ello:

a) se acondicionan las muestras de sangre y los estándares con modificador de matriz.

b) se colocan en forma individual y automatizada en una plataforma de L´vov de temperatura estable,

instalada en un tubo de grafito pirolítico.

c) se someten a un tratamiento térmico inducido por resistencia eléctrica.

d) se hace pasar a través de la nube atómica obtenida, un haz de luz generado por lámparas específicas

de cátodo hueco o de descarga sin electrodo.

e) se obtiene la respuesta instrumental de absorbancia integrada, usando un corrector de fondo.

f) se compara la absorbancia integrada de muestras y estándares para obtener la concentración de plomo

en la sangre estudiada.

3.2 Reactivos

Todas las sustancias químicas deben cumplir con los requerimientos de pureza:

A) Agua tipo I: >10.0 MÙ cm

-1

B) Acido nítrico (HNO3) ultrapuro.

C) Fosfato dibásico de amonio ultrapuro (NH4)2 HPO4.

D) Octil-fenoxi-polietoxietanol (Tritón X-100).

E) Estándar de plomo [1000 µg/ml] con certificado de análisis.

F) Control de plomo en sangre con certificado de análisis, emitido por un organismo internacional

reconocido.

3.3 Material y equipo

3.3.1 Espectrofotómetro de absorción atómica equipado con horno de grafito, corrector de fondo

y muestreador automático.

3.3.2 Lámpara de plomo de cátodo hueco o de descarga sin electrodo.

3.3.3 Utilizar argón o nitrógeno como gas de purga, de grado Alta Pureza.

3.3.4 Tubos de grafito pirolítico.

3.3.5 Plataformas de L´vov.

3.3.6 Pipeta volumétrica o probetas de 10 ml.

3.3.7 Micropipetas con capacidad de: 20 µl volumen fijo; y de 100 µl y 1000 µl volumen variable.

3.3.8 Puntas de plástico para micropipetas.

3.3.9 Matraces volumétricos clase A de: 10, 100 y 1000 ml.

3.3.10 Copas de muestreo.

3.3.11 Guantes para trabajo en el laboratorio.

3.3.12 Balanza con capacidad de resolución 0.001 gr.

3.3.13 Refrigerador (4 a 8ºC).

3.4 Preparación de la muestra y estándares

Nota: Usar siempre agua tipo I: ###10.0 M### cm-1.

a) Solución modificadora de matriz:

En un matraz aforado de 100 ml añadir 0.2 g. de fosfato dibásico de amonio y la cantidad mínima de agua

para obtener su disolución; adicionar 0.5 ml de Tritón X-100 y 0.2 ml de ácido nítrico ultrapuro. Mezclar

y aforar con agua.

b) Solución de lavado para el automuestreador:

Colocar al menos 200 ml de agua en un recipiente de polipropileno de 2 litros previamente lavado.

Agregar al recipiente de polipropileno 10 ml de Tritón X-100 medidos con una probeta o pipeta de 10 ml,

agitar hasta disolución.

Lavar 3 veces pipeta volumétrica o la probeta con agua y agregar el agua de lavado al recipiente

de polipropileno.

Llenar con agua el recipiente de polipropileno hasta un 90% de su volumen total y agitar para mezclar

la solución.

Adicionar el agua faltante según lo permita el nivel de espuma formado (esta solución se prepara según

se requiera por el equipo).

c) Preparación de Estándares:

c.1 Solución patrón de plomo con certificado de análisis [1000 µg/ml]

De acuerdo a las instrucciones de dilución del fabricante obtener una solución patrón de 1000 µg/ml en

ácido nítrico ultrapuro al 5%. La vigencia de esta solución es de un año.

c.2 Solución intermedia de plomo [10 µg/ml]

En un matraz volumétrico de 100 ml poner 1 ml de solución patrón de plomo [1000 µg/ml]y 5 ml de ácido

nítrico y aforar con agua. La vigencia de esta solución es de un mes .

c.3 Soluciones de trabajo

Preparar cada semana los estándares de trabajo de 50, 100, 250, 500 y 750 µg/l (5, 10, 25, 50 y 75 µg/dl)

de la siguiente manera:

De la solución intermedia de plomo [10 µg/ml] tomar las siguientes alícuotas, y colocarlas en matraces

volumétricos de 10 ml.

Solución intermedia

de plomo [10 µl/ml]

µl

HNO3

µl

Aforo con agua Concentración de las

soluciones de trabajo

50 500 ### 50 ###g/l o 5 ###g/dl

100 500 ### 100 ###g/l o 10 ###g/dl

250 500 ### 250 ###g/l o 25 ###g/dl

500 500 ### 500 ###g/l o 50 ###g/dl

750 500 ### 750 ###g/l o 75 ###g/dl

NOTA: Se podrán preparar soluciones de trabajo cuyas concentraciones se encuentren dentro del

intervalo de linearidad del método (desde el límite de cuantificación hasta 80 ###g/dl de concentración).

d) Preparación de estándares de calibración y de las muestras:

Preparar los estándares de calibración en las copas de muestreo.

d.1 Con modificador de matriz.

Preparar los estándares de calibración y las muestras como se describe en el cuadro número 1,

cumpliendo con el intervalo de concentración del cuadro.

CUADRO No. 1

MODIF. AGUA SOLUCIONES DE TRABAJO MUESTRAS CC

MATRIZ

(µl) (µl)

50

[µg/l]

100

[µg/l]

250

[µg/l]

500

[µg/l]

750

[µg/l]

µl µl

BLANCO

REACTIVO

900 100 - - - - - - -

ESTANDAR

5 µg/dl 900 - 100µ1 - - - - - -

ESTANDAR

10 µg/dl 900 - - 100µ1 - - - - -

ESTANDAR

25 µg/dl 900 - - - 100µ1 - - - -

ESTANDAR

50 µg/dl 900 - - - - 100µ1 - - -

ESTANDAR

75 µg/dl 900 - - - - - 100µ1 - -

MUESTRAS

900 - - - - - - 100 -

*CC 900 - - - - - - - 100

*CC (Control de plomo en sangre con certificado de análisis

d.2 Con adición de estándar

Preparar los estándares de calibración y las muestras como se describe en el cuadro número 2. Usar

como sangre base una muestra previamente preparada y analizada según el punto 3.5 y cuyo contenido de

plomo sea < 10.0 µg/dl.

Homogeneizar la muestra de sangre con agitación suave y adicionar la alícuota como se señala en el

cuadro 2, enjuagar y mezclar mediante bombeo repetido con la micropipeta, utilizando la punta como agitador

para eliminar de ésta toda traza de sangre.

CUADRO No. 2

MODIF. AGUA SOLUCIONES DE TRABAJO SANGRE MUESTRAS CC

MATRIZ

(µl) (µl)

50

[µg/l]

100

[µg/l]

250

[µg/l]

500

[µg/l]

750

[µg/l]

BASE µl µl

BLANCO

REACTIVO

8 0 0 1 0 0 ----- 1 0 0--

ESTANDAR

5 µg/dl 800 - 100µ1 - - - - 100 - -

ESTANDAR

10 µg/dl 800 - - 100µ1 - - - 100 - -

ESTANDAR

25 µg/dl 800 - - - 100µ1 - - 100 - -

ESTANDAR

50 µg/dl 800 - - - - 100µ1 - 100 - -

ESTANDAR

7 5 µ g / d l 8 0 0 - ---- 100µ1 100 - -

MUESTRAS

9 0 0 - ---- -1 0 0 -

* C C 9 0 0 - ------ - 1 0 0

*CC (Control de plomo en sangre con certificado de análisis

3.5 Procedimiento

3.5.1 El área de preparación y análisis de las muestras debe ser aislada, estar limpia y libre de polvo.

3.5.2 Los parámetros instrumentales son los siguientes:

Longitud de onda: 283.3 nm.

Tipo de señal: absorbancia integrada.

Medición de la señal: área del pico.

Ancho de banda: de acuerdo a las especificaciones de cada instrumento.

Los parámetros como las temperaturas y los tiempos de: secado, calcinado y atomizado del horno de

grafito se establecen a partir de las especificaciones de operación y se optimizan en cada laboratorio.

3.5.3 Curva de calibración

Elaborar una curva de absorbancia integrada vs concentración con estándares acuosos de plomo o una

curva de calibración con adición de estándar, debiendo obtener un coeficiente de correlación r > 0.995.

Analizar los controles de plomo en sangre con certificado de análisis, en caso de que algún valor esté

fuera del intervalo certificado volver a preparar la curva de calibración.

3.5.4 Análisis de la muestra

Analizar las muestras, usando la longitud de onda de 283.3 nm y corrector de fondo.

El análisis se realiza por duplicado, tomando 20

µl de muestra.

3.5.5 Control de calidad

Analizar el control de plomo en sangre con certificado de análisis cada 20 muestras leídas, para

comprobar la calidad de los resultados.

En caso de que la lectura del control de plomo en sangre esté fuera del intervalo certificado, recalibrar y

repetir las lecturas del último lote de muestras.

Cuando alguna muestra exceda el intervalo lineal definido con esta curva, se analizará nuevamente,

realizando una dilución 1:20 de la siguiente manera: 100 µl de sangre más 1900 µl de modificador de matriz.

3.5.6 Expresión de los resultados

Para calcular la concentración de plomo de muestras, se interpola el valor de absorbancia integrada en la

gráfica de la curva de calibración.

Para muestras que se han diluido considerar el factor de dilución.

La concentración de plomo en las muestras se reporta en µg/dl, con una cifra decimal.

3.5.7 Límite de detección

Límite de detección 1.5 µg de plomo/dl de sangre.

3.5.8 Linearidad

Desde el límite de cuantificación establecido para las condiciones específicas de operación hasta 80.0 µg

de plomo/dl de sangre.

3.5.9 Precisión

Coeficiente de variación < 10%.

4. Método de prueba

Voltamperometría de redisolución anódica

Método para la determinación de plomo en sangre por voltamperometría de redisolución anódica.

El análisis se realiza con 100 ###l de sangre, por duplicado.

Este método es adecuado para evaluar el plomo en sangre total que tenga concentraciones de este metal

en un intervalo de 1 a 100###g/dl.

4.1 Principio del método

La voltamperometría de redisolución anódica es un método de alta precisión virtualmente libre de

interferencias. 1) La sangre se añade en el reactivo apropiado para la rápida liberación del plomo de

la muestra. 2) El plomo de la muestra se concentra y deposita en un electrodo de mercurio/grafito, durante la

etapa de electrodeposición. 3) El plomo depositado se remueve del electrodo en la etapa de redisolución,

y se cuantifica por la integración del pico de corriente resultante de una rápida reacción electroquímica, el

área del pico que se obtiene durante la etapa de redisolución, es proporcional a la cantidad de plomo

presente en la sangre.

4.2 Reactivos

Los apropiados para la determinación de plomo en sangre por voltamperometía de redisolución anódica

de acuerdo al equipo utilizado.

a) Reactivo que cumpla con las propiedades requeridas para la determinación de plomo en sangre, por

voltamperometría de redisolución anódica.

b) Agua tipo I: >10.0 MÙ cm

-1

c) Reactivos de calibración de plomo específicos para voltamperometría de redisolución anódica con

concentración para la calibración (dentro del intervalo de calibración de 5 a 100µg/dl).

d) Controles de plomo en sangre con certificado de análisis de un organismo internacional reconocido.

4.3 Material y equipo

Todo el material que sea utilizado en la determinación de plomo en sangre y que se encuentre en

contacto con el equipo y la sangre debe estar libre de plomo.

4.3.1 Voltámetro con capacidad de analizar muestras de sangre cuyas concentraciones de plomo sean de

1 a 100 ###g/dl.

4.3.2 Micropipetas de volumen fijo 100 µl.

4.3.3 Puntas desechables para micropipetas lavadas de acuerdo al inciso 2.2.

4.3.4 Guantes.

4.3.5 Piseta.

4.4 Preparación del equipo:

El voltámetro debe ser preparado de acuerdo a los procedimientos del manual de operación del fabricante

y cumplir con las indicaciones propias para la determinación de plomo en sangre.

4.5 Calibración del equipo

Calibrar el equipo siguiendo el procedimiento de operación y analizar por duplicado los controles de

calibración.

4.6 Control de calidad

Analizar los controles de plomo en sangre con certificado de análisis inmediatamente después de la

calibración y después de cada 20 muestras leídas, para comprobar la calidad de los resultados.

Verificar la linearidad del instrumento con los controles propios para voltamperometría.

En caso de que la lectura de los controles de plomo certificados esté fuera del intervalo, recalibrar

y repetir las lecturas del último lote de muestras.

Cuando el resultado de una muestra exceda el intervalo definido en la curva de calibración, se debe

repetir el análisis utilizando 50

µl de sangre.

4.7 Expresión de resultados

Los resultados de los análisis deben expresarse en ###g/dl con una cifra decimal.

4.8 Límite de detección

1µg/dl de plomo.

4.9 Linearidad

De 5.0 a 100.0

µg/dl de plomo en sangre.

4.10 Precisión

Coeficiente de variación < 10%.