Apéndice D — NOM-002-SAGARPA-2016, Relativa a las características de sanidad, calidad agroalimentaria, autenticidad, etiquetado y evaluación de la conformidad de los fructanos de agave.

APÉNDICE D

ANÁLISIS DE MASA MOLECULAR Y DISTRIBUCIÓN DEL GRADO DE POLIMERIZACIÓN DE

FRUCTANOS DE AGAVE

1. Introducción.

La distribución de peso molecular (o alternativamente grado de polimerización) es un pará metro de suma

importancia en la caracterización de los fructanos de agave, pues sus propiedades tecno -funcionales (tales

como viscosidad, dulzor, disminución del punto de fusión entre otras) y sus propiedades funcionales

(selectividad de los microorganismo s prebióticos que los utilizan como alimento) dependen de la longitud y

conformación de las moléculas presentes en el fructano.

2. Objetivo y campo de aplicación.

Determinar la distribución de peso molecular o grado de polimerización de una muestra de fruc tanos de

agave

3. Principio/fundamento.

El análisis de masa molecular de muestras de fructanos se lleva a cabo en un sistema de cromatografía de

exclusión de tamaño (SEC, por sus siglas en inglés). La cromatografía por exclusión de tama ño separa las

moléculas al ser é stas excluidas selectivamente de una matriz porosa en base a su radio de giro

hidrodinámico de giro. El sistema consiste en columnas con diferentes rangos de masas moleculares y con un

detector de índice de refracción diferencial y es calibrado con estándares de peso molecular conocido y de

estructura similar a la muestra a analizar. La calibración del sistema se realiza con estándares adecuados con

masa molecular definida como dextranos, fructooligosacáridos, sacarosa y fructosa, lo que permite por

comparación obtener la distribución de pesos moleculares de las especies presentes en la muestra. Los

cálculos de masa molecular y distribución de peso molecular a partir de los perfiles por cromatografía de

exclusión de tamaño (SEC) se realizan en un programa desarrollado específicamente (CPCWin32). El

programa calcula las distribuciones de masa molecular y grado de polimerización, así como la masa molar

media, masa molar promedio en número (Mn) y masa molar promedio en peso (Mw). Adicionalmente la

relación de Mw/Mn muestra el índice de polidispersidad (PD, por sus siglas en inglés) de las muestras de

fructanos. Estos parámetros moleculares esenciales aportan perfiles significativos para diferentes

composiciones de fructanos.

En general, la masa molar promedio en número y en peso (Mn, Mw) así como su correspondiente grado

de polimerización promedio en número y en peso (dpn, dpw) son calculadas como momentos de la

distribución de masa molar.

4. Equipos y materiales.

4.1 Sistema de Cromatografía de líqu idos de alto desempeño - Cromatografía de exclusión de tamaño

(HPLC – SEC).

4.2 Bomba isocrática

4.3 Automuestreador capaz de inyectar 100 µl

4.4 Módulo desgasificador de eluente (opcional)

4.5 Detector de masa (detector de Índice de Refracción Diferencial (DRI por sus siglas en inglés)

4.6 Software de adquisición de datos (Codawin32) o sistema equivalente.

4.7 Software para análisis de SEC. CPCWin32.

4.8 Sistema de columnas SEC.

4.9 1 guarda-columna empacada con Toyopearl HW 40S. (150 x 10 mm d.i.)

4.10 1 columna analítica empacada con Superose 12 (300 x 10 mm d.i.)

4.11 2 columnas analíticas empacadas con Toyopearl HW 40S (300 x 10 mm d.i)

4.12 Balanza analítica. Sensibilidad de 0.01 mg.

4.13 Tubos para reacción. 1.5 mL con fondo cónico

4.14 (Tubos Eppendorf de polipropileno para microcentrífuga o equivalentes)

4.15 Racks para tubos de reacción. Adecuado para tubos plásticos con fondo cónico Eppendorf de 2 mL o

equivalente.

4.16 Agitador tipo Vortex.

4.17 Botella con tapa roscada. Capacidad de 4 L para eluente.

4.18 Matraz aforado. Capacidad de 4 L para preparación de eluente.

4.19 Vaso de precipitado de vidrio. Capacidad de 500 mL.

4.20 Agitador magnético y barras de agitación de diferentes tamaños.

4.21 Baño ultrasónico.

4.22 Agitador tipo Vortex.

4.23 Micropipetas automáticas de volumen variable: incluyendo volúmenes de 500 a 5000 µL, 500 a 2500

µL, 200 a 1000 µL, 50 a 200 µL, 5 a 50 µL y 2 a 20 µL.

4.24 Filtro para jeringa. Tamaño del poro de 0.2 ó 0.45 µm, Nylon (Millipore Millex HN, 13 mm, 0.45 µm,

SLHNX13NL) o similar

4.25 Jeringas. Punta Luer Lock, capacidad de 1 mL, de plástico.

4.26 Equipo de filtrado al vacío. Millipore o equivalente, diámetro de 48 mm y capacidad del recipiente y

embudo de 1 l.

4.27 Filtro de nylon o de acetato de celulosa. 48 mm de diámetro, 0.45 µm. Millipore o equivalente.

4.28 Preparación de la muestra y reactivos

5. Reactivos.

5.1 Agua. ASTM Tipo 1 o equivalente.

5.2 Agente bacteriostático. Azida de sodio (preferido) o timerosal

5.3 Cloruro de sodio. Grado reactivo.

5.4 Fructosa. Cristalina, grado reactivo.

5.5 1-Kestosa. Cristalina, grado reactivo.

5.6 Kit de estándares de Dextrano para GPC Pharmacosmos. (incluyendo dextrano 1, 5, 50 y 150)

5.7 Resina Toyopearl HW 40S.

5.8 Eluente

Preparar solución 0.05 M de NaCl con 0.01% de c onservador (Azida de sodio o equivalente). Filtrar el

eluente con membrana de 0.22 µm. Degasificar con purga de helio por 40 min, o colocando la solución en el

baño ultrasónico a 80ºC por 1 h.

6. Empacado de las columnas.

Empaque de columna Tricorn – 300 x 10 mm diámetro interno. Volumen total de columna: 20 mL

aproximadamente.

7. Preparación del gel.

Se deben tomar 50 mL de resina Toyopearl HW 40 S (30 µm) en una probeta graduada de 250 mL o en un

vaso de precipitado del mismo volumen, agregue 100 mL de ag ua destilada y se debe suspender la resina

agitando cuidadosamente la superficie. Se debe permitir que la suspensión se asiente (2 a 4 horas o durante

toda la noche) y se debe remover las partículas finas del sobrenadante. Se debe ajustar la concentración de la

suspensión al 50% de s ólidos añadiendo agua destilada o removiendo el sobrenadante para alcanzar la

consistencia del relleno de la columna.

8. Empacado de la columna.

Se debe verificar que la columna está armada antes de empezar el empacado. Después de fijar la unidad

inferior con su filtro (usar el filtro grueso) a la columna Tricorn, se vierten 5 cm de agua dentro de la columna y

se permite que fluya algunos segundos a través de la unidad inferior para eliminar todas las burbujas de aire.

Conecte la salida de la columna y deje de 1 a 2 cm de agua en el fondo de la columna.

Se debe volver a suspender la resina para asegurar la homogeneidad.

Se debe verter cuidadosamente la suspensión de resina por la pared interna de la columna. Evite que

quede atrapado aire en la suspensión de resina.

Una vez que la resina haya sido transferida a la columna, se debe n enjuagar las paredes internas de la

columna con agua destilada utilizando una pipeta Pasteur. Se debe colocar inmediatamente el adaptador de

flujo de la columna sobre la suspensión de resina. No debe de haber burbujas de aire entre el adaptador de

flujo y el agua superficial.

Se debe abrir la salida de la columna y arranque la bomba. Comience lentamente con 0.5 mL/min para un

mejor acomodo de la suspensión.

Después de 10 minutos se debe aumentar el flujo de la bomba a 1.0 mL/min y permita que la suspensión

se asiente totalmente (hasta que el lecho de gel no cambie).

Se debe apagar la bomba y cierre la salida de la columna. Se debe abrir el adaptador de fluj o y utilizando

una pipeta (Pasteur), separe el sobrenadante acuoso del gel.

Se debe volver a llenar la suspensión y repita desde el paso 2 al 7 hasta que el lecho de resina se haya

formado completamente. Aplique un flujo de 1.0 mL/min durante el llenado.

Se debe cambiar de agua a eluente (0.05 M NaCl con 0.01% NaN3) hasta que ya no haya más

compresión del lecho de resina por el adaptador de flujo (< 0.5 cm). Usualmente toma de 2 a 3 repeticiones

hasta que el lecho esté estable. La presión de todo el sistema de columnas no deberá de ser mayor a 12 bar.

De ser así, vaciar las columnas y volver a empacar.

Finalmente, se debe bajar el adaptador hacia el lecho entre 1 y 5 mm. La columna está lista para su uso.

9. Soluciones estándar.

Estándar 1. Fructosa (1 mg) – PM 180 + Dextrano 1 (3 mg) – PM 1080 (pico máximo) + Dextrano 50 (3

mg) – PM 43,500 (pico máximo) disueltos en 1 mL de eluente.

Estándar 2. 1-kestosa (1 mg) – PM 504 + Dextrano 5 (3 mg) – PM 4440 (pico máximo) + Dextrano 150 (3

mg) – PM 123,600 (pico máximo) disueltos en 1 mL de eluente

Antes de inyectar, filtre a 0.22 µm o centrifugue por 5 minutos a 13,000 rpm en una microcentrífuga y tome

el sobrenadante.

10. Preparación de las muestras.

Se debe pesar 20 mg de muestra de fructanos en un tubo de reacción de 1.5 mL y disuélvalo en 1 mL de

eluente. Antes de la inyección de 100 µL de muestra en el sistema SEC filtre a través de filtros para jeringas o

centrifugue por 5 minutos a 13,000 rpm en una microcentrífuga.

11. Procedimiento.

11.1 Parámetros de separación cromatográfica:

Flujo de eluente, 0.6 mL/min. Se debe estabilizar el equipo y detector por al menos 6 horas antes de

inyectar muestras. Se deben escoger parámetros de detector de tal manera que la polaridad dé picos

positivos y la sensibilidad del equipo sea la adecuada.

11.2 Análisis de estándares.

Se deben aplicar los diferentes estándares con diferentes masas moleculares para la calibración en las

siguientes formas:

11.2.1 Estándar 1 (Fructosa, PM 180 + Dextran 1, PM 1080 + Dextran 50, PM 43,500)

11.2.2 Estándar 2 (1-kestosa, PM 504 + Dextran 5, PM 4440 + Dextran 150, PM 123,600)

11.3 Análisis de muestras

Volumen de inyección de muestra. 0.1 mL de 0.2% w/w de carbohidratos o el adecuado a que el detector

dé una respuesta adecuada.

11.4 Evaluación de los resultados

Análisis y evaluación de perfiles de Cromatografía de Exclusión de Tamaño (SEC)

Se debe calcular la distribución de masa molecular y de grado de polimerización, así como sus parámetros

moleculares por medio del software CPCWin32.

11.5 Calibración del sistema SEC

Figura 1: Calibración del sistema SEC. Estándar 1: negro; Estándar 2: azul. Estándar 1: 0.9 mg Fructosa +

2.5 mg Dextran 1 (1080 Da) + 3.15 mg Dextran 50 (43500 Da), Estándar 2: 1.72 mg 1 -Kestosa + 3.06 mg

Dextran 5 (4440 Da) + 2.57 mg Dextran 150 (123600 Da)

Interpretación de resultados para calibración:

Se debe aplicar el volumen de retención en el pico máximo de los estándares y calcule en comparación al

logaritmo de la masa molecular en el pico máximo (Tabla 1, Fig. 2). Estas comparaciones fueron hechas en un

documento de Excel

y transferidas al software de análisis CPCWin32 para la preparación de la curva de

calibración de masa molecular bajo la aplicación de un programa de ajuste lineal. Para el análisis de la

distribución de masa molecular y sus parámetros moleculares, esta curva ajustada fue aplicada en los

cálculos.

Tabla 1: Peso molecular y volumen de elución en el pico máximo de los estándares aplicados.

Estándar Peso Molar (MW) log Peso Molar (log MW) Ve (ml)

Dextran 150 123600 5.09 27.40

Dextran 50 43500 4.64 30.8

Dextran 5 4440 3.65 40

Dextran 1 1080 3.03 46.8

1-Kestosa 504 2.70 52.3

Fructosa 180 2.26 56.7

11.6 Análisis de fructanos de agave en el sistema SEC

Preparación de la muestra: 10.4 mg de fructanos de aga ve disueltos en 0.5 mL de eluente, (30 segundos

en agitador tipo Vortex, 5 minutos centrifugado a 13,000 rpm); inyección: 100 µL

Figura 2: Calibración del sistema SEC con estándares 1 y 2 (puntos triangulares, valores de los

picos máximos) y su curva de ajuste lineal (fit_MWV)

11.7 Análisis de fructanos de agave en el sistema SEC

Preparación de la muestra: 10.4 mg de fructan os de agave disueltos en 0.5 mL de eluente, (30 segundos

en agitador tipo Vortex, 5 minutos centrifugado a 13,000 rpm); inyección: 100 µL

Fig. 3: Perfil SEC de fructanos de agave en sistema SEC; rango de integración para análisis de

masa molecular (líneas rojas).

Para el análisis de la distribución de masa molecular, el resultado del perfil SEC fue transformado en

fracción masa con área total = 1 (ver Fig. 4). Este perfil SEC normalizado fue aplicado para la distribución de

masa molecular por medio de la curva ajustada (Fig. 2) de la calibración de masa molecular. Para el análisis

de la distribución de masa molecular se aplicó únic amente el rango comprendido entre las 2 líneas rojas; los

mono- y disacáridos (glucosa, fructosa y sacarosa) no se incluyen (Fig. 5). Para el análisis de la distribución

del grado de polimerización (dp) los valores molares se dividen entre la unidad del monómero de 162 (Fig. 6)

Fig. 4 Perfil SEC normalizado de fructanos de agave en sistema SEC. intervalo de integración para

análisis de masa molecular (líneas rojas).

Fig. 5: Distribución de masa molecular (MW) de fructanos de agave en formato logarítmico:

Parámetros moleculares calculados: m_Mw= 2870 [g/mol] y m_Mn=1640 [g/mol], polidispersidad es

m_(Mw/Mn)=1.75.

Fig. 6: Distribución del grado de polimerización (dp) de los fructanos de agave en formato

logarítmico: Parámetros moleculares calculados: m_dpw= 18 y m_dpn=10, polidispersidad es

m_(dpw/dpn)=1.8.

Fig. 7: Distribución del grado de polimerización (dp) de fructanos de agave en formato lineal:

Parámetros moleculares calculados: m_dpw= 18 y m_dpn=10, polidispersidad es m_(dpw/dpn)=1.8.

Para una mejor comprensión del perfil de polímeros de fructanos de agave, el perfil logarítmico puede

transformarse a una distribución de dp lineal (fig. 7).

Adicionalmente a los parámetros moleculares, los perfiles normalizados de masa molecular y grado de

polimerización (dp) permiten el cálculo del porcentaje de fructanos de agave en relación a la masa molecular

y/o al rango del grado de polimerización. La Tabla 2 presenta los resultados de los fructanos de agave

(ejemplo 2)

Tabla 2: Porcentaje del grado de polimerización (dp) de los componentes en la muestra de

Fructanos.

Muestra DP ≤10 (%w/w) DP 10 - 20 (%w/w) DP 20 - 100 (%w/w)

Fructano de agave 12 29 59

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