Apéndice C — NOM-002-SAGARPA-2016, Relativa a las características de sanidad, calidad agroalimentaria, autenticidad, etiquetado y evaluación de la conformidad de los fructanos de agave.

APÉNDICE C

MÉTODO DE PRUEBA PARA EL ANÁLISIS DE LOS ENLACES GLUCÓSIDOS PRESENTES EN LOS

FRUCTANOS DE AGAVE

1. Introducción

Los fructanos de agave son polímeros de fructosa con una posible glucosa intermedia y varios sitios de

ramificación. Es decir, cuent an con enlaces glucósidos tipo β(2-1) y β(2-6). En productos terminados, por

hidrolisis parcial durante el proceso puede haber fragmentos de estos. El análisis de los enlaces permite saber

si una muestra de fructanos de agave ha sido adulterada con fructanos tipo inulina.

2. Objetivo y campo de aplicación

El presente método es utilizado para la detección de adulterantes en los fructanos de agave, así como

para conocer su estructura promedio.

3. Principio/fundamento

Para determinar la estructura y tipos de e nlaces presentes en una muestra de fructanos, el análisis por

metilación, en combinación con cromatografía de líquidos-gases (GLC) acoplada a detección por ionización de

flama o espectrometría de masas es un excelente método.

Los fructanos son O -permetilados, y la subsecuente escisión en condiciones reductivas del polímero,

seguida de la acetilación de los resultantes grupos hidroxilo libres, resulta en diferentes derivados del

anhidroalditol según su posición original en el polímero.

4. Equipos y materiales

4.1 Cromatógrafo de líquidos-gases acoplado a detector de ionización de flama (FID) o por espectrometría

de masas (MS), incluyendo automuestreador.

4.2 Columna cromatográfica. Fase estacionaria (14% -cianopropil-fenil) metilpolisiloxano. Longitud 30 m,

espesor de capa 0.25 m, diámetro 0.25 mm.

4.3 Balanza analítica. Sensibilidad de 0.01 mg.

4.4 Horno de vacío. Con capacidad de mantener 55 ± 3ºC.

4.5 Tubos de reacción de vidrio, con tapa roscada y sello de PTFE.

4.6 Desecador. Con SiO 2, o desecante equivale nte. Secar el desecante cada 2 semanas dejándolo 8

horas a 130ºC en el horno a vacío.

4.7 Pipetas pasteur de vidrio, punta larga.

4.8 Agitador magnético y barras de agitación adecuadas para los tubos y vasos de reacción.

4.9 Tubos cónicos de plástico para reacción (Tubos Safe -Lock).- 2.0 mL (Tubos Eppendorf No. 0030

120.094 para microcentrífuga) o equivalentes.

4.10 Racks para tubos cónicos de plástico para reacción.- Adecuado para los tubos Eppendorf.

4.11 Agitador tipo Vortex.

4.12 Micropipetas automáticas de volumen variable: incluyendo volúmenes de 500 a 5000 µL, 500 a 2500

µL, 200 a 1000 µL, 50 a 200 µL, 5 a 50 µL y 2 a 20 µL.

5. Preparación de la muestra y reactivos

5.1 Reactivos

5.1.1 Dimetilsulfóxido.

5.1.2 Hidróxido de sodio granulado

5.1.3 Yoduro de metilo

5.1.4 Cloroformo

5.1.5 Cloruro de metileno

5.1.6 Sulfato de sodio

5.1.7 Tamices moleculares, 4Å, para secado de solventes

5.1.8 Bicarbonato de sodio

Todos grado ACS y con la menor cantidad de humedad posible.

6. Preparación de los reactivos

Todos los solventes deberán de ser manejados en condiciones libres de humedad. De ser necesario,

secar los solventes con los tamices moleculares para asegurar la sequedad de los reactivos.

7. Preparación de muestras

Secar en el horno de vacío a 55°C y 10-20 mbar por 12 horas las muestras antes de ser analizadas.

8. Procedimiento

8.1 Metilación

Disolver 5 mg de muestra una vez secas (este paso es sumamente importante) en 0.5 ml de

dimetilsulfóxido. Ya disueltas, alcalinizar con 20 mg de hidróxido de sodio en polvo y seco y agitar por 15

minutos o hasta que el NaOH quede casi disuelto. Añadir 0.5 ml más de dimetilsulfóxido. Si la solución es

amarillenta o café, significa que las muestras o solventes no estaban lo suficientemente secos. Metilar

añadiendo 0.5 ml de yo duro de metilo y agitar a temperatura ambiente de 4 a 6 horas. Añadir 0.2 ml más de

yoduro de metilo y dejar agitando durante la noche. Agregar 5 ml de agua para detener la reacción. Añadir 1

ml de cloruro de metileno. Agitar muy bien por 5 minutos, centri fugar y tomar la fase orgánica y secar

añadiendo una pequeña cantidad (aproximadamente 1/4 del volumen de fase orgánica presente) sulfato de

sodio seco.

Como nota final, en necesario recalcar que para que la reacción se lleve a cabo la reacción debe de

llevarse en condiciones absolutamente anhidras.

8.2 Ruptura reductiva

Tomar 0.25 ml de la solución de polisacáridos metilados y añadir en el siguiente orden: 0.036 ml de

trimetilsilano como agente reductor, 0.020 ml de trimetilsililtrifluorometanosulfonato c omo catalizador y agitar

por lo menos 7 horas, o de preferencia toda una noche. Añadir 0.050 ml de anhídrido acético. Agitar por 3

horas a temperatura ambiente. Neutralizar con 5 ml de solución saturada de bicarbonato de sodio separar la

fase orgánica, lav ar dos veces más con agua y añadir un volumen (0.5 ml) de cloruro de metilo. Finalizado

este paso, secar la solución con sulfato de sodio al menos por 12 horas, al terminar este tiempo la muestra

queda lista para su análisis por GLC. Al igual que la reacci ón anterior, las condiciones deben de ser

absolutamente anhidras.

8.3 Corrida cromatográfica

Volumen de inyección: 2 µl

Programa de temperatura: 80°C inicial, incremento de 10°C/min hasta llegar a 140°C, e incremento de

4°C/min hasta llegar a 250°C

Gas acarreador: Helio, presión 1.0 - 1.2 bar

Temperatura de inyección: 230°C

Temperatura de detección: 300°C

Se pueden correr estándares de sacarosa, 1 -kestosa y fructosa junto con las muestras permetilados para

corroborar que la reacción ha dado los resultados e sperados, así como para conocer las posiciones relativas

de cada uno de los anhidroalditoles derivados para su posterior identificación en la muestra.

9. Evaluación de los resultados

En la tabla 1 se muestras los posibles anhidroalditoles derivados resulta ntes de las diferentes unidades de

sacáridos presentes en los fructanos de agave:

Tabla 1. Productos de la reacción de metilación y ruptura reductiva de fructanos de agave

El sitio reductivo de las aldosas (i.e. glucosa) só lo genera un tipo de glucitol después de la reacción, ya

que el carbono en esta posición no es quiral, mientras que las cetosas (i.e. fructosa) resultan en una molécula

con un centro quiral, por lo que resultan en dos formas anoméricas de glucitol.

Los siguientes esquemas muestra n los resultados de la reacción en diferentes tipos de enlaces como

ejemplo, utilizando la numeración de los productos de la tabla 1.

Esquema 1

Esquema 2

Esquema 3

Esquema 4

Con la información anterior y los resultados obtenidos del análisis de l a muestra es posible entonces

deducir la estructura de moléculas de fructanos más complejas es necesario recordar que los resultados

obtenidos son el promedio de todos los isómeros y polímeros de fructanos presentes en la muestra. Por

ejemplo, para los fructanos tipo inulina:

Fructanos de agave