Numeral 15 — NOM-056-ZOO-1995, Especificaciones técnicas para las pruebas diagnósticas que realicen los laboratorios de pruebas aprobados en materia zoosanitaria.

15 Fiebre porcina clásica

Título

Aislamiento del Virus de Fiebre Porcina Clásica (FPC) en microplacas, evidenciado por

inmunoperoxidasa.

Objetivo

Aislar el virus de casos clínicos de FPC y evidenciar el antígeno por técnicas inmunoenzimáticas

(inmunoperoxidasa).

Campo de aplicación

En la confirmación del diagnóstico de FPC como apoyo a la Campaña Nacional contra la FPC.

Documentos a consultarse

Norm a Oficial Mexicana NOM-003-ZOO-1994, Criterios para la operación de laboratorios de pruebas

aprobados en materia zoosanitaria.

Norma Oficial Mexicana NOM -029-ZOO-1995, Características y especificaciones para las

instalaciones y equipo de laboratorios de pr uebas y/o análisis en materia zoosanitaria.

Norma Oficial Mexicana NOM-037-ZOO-1995, Campaña Nacional contra la Fiebre Porcina Clásica.

Generalidades

La prueba se utiliza para aislar el agente etiológico de la FPC, a partir de muestras remitidas para su

diagnóstico por Inmunofluorescencia: tonsila, bazo, ganglio y riñón, los cuales se maceran, filtran e

inoculan en monoestratos de líneas celulares de riñón de cerdo (PK15), de testículo de cerdo (ST) ya

que éstas son susceptibles a la replicación del virus d e FPC.

Equipos e instrumentos

1. Autoclave escala de 1.5 kg de presión a 121°C.

2. Balanza con escala de 0.001 g a 10 g, mínimo

3. Centrífuga refrigerada escala de 0 a 5000 rpm y de 0°C a -25°C.

4. Congelador con escala de temperatura de 0°C a -30°C.

5. Estufa bacteriológica con suministro de CO2, rango de temperatura de 22°C a 40°C.

6. Microscopio óptico, con objetivos seco débil, seco fuerte e inmersión

7. Microscopio invertido, objetivos: panorámico, seco débil y seco fuerte

8. Refrigerador con capacidad mínima de 9 pies cúbicos con congelador integrado

9. Ultracongelador (Revco) con escala de 0°C a -70°C.

Materiales

1. Botellas para cultivos celulares de 5 a 15 ml.

2. Cajas de Petri

3. Filtros con membrana de .45 y .22 micrómetros de diámetro

4. Marcadores de tinta indeleble

5. Microplacas de plástico, con 96 pozo, fondo plano

6. Mortero de porcelana con pistilo y mortero de Stenbrook

7. Multipipetas con 8 o 12 canales

8. Pinzas y tijeras

9. Pipetas de 5, 10 y 20 ml.

10. Probetas de 100 ml.

11. Puntas para multipipeta

12. Tubos de centrífuga

Reactivos

1. Amino -9-etilcarbazol (cromógeno)

2. Acetona al 30%

3. Albúmina sérica bovina al .02%

4. Antibióticos en polvo (penicilina/estreptomicina)

5. Bicarbonato de sodio en solución al 7%

6. Conjugado p ara inmunoperoxidasa (proteína G+peroxidasa)

7. H2O2 al 30% (sustrato)

8. Medio mínimo esencial (MEM) completo

9. Solución amortiguadora de fosfato SAF, pH 7.2

10. Solución de fosfatos .01 M + tween 20 (SAF-L)

11. Solución de fosfatos .01 M + NaCl 2.1% + T ween 20 al 0.5% (SAF-D)

12. Soluciones A y B

Biológicos

1. Líneas celulares de riñón de cerdo (PK15) y de testículo de cerdo (ST)

2. Suero de cerdo, hiperinmune contra el virus de la FPC

3. Suero Fetal Bovino, libre de virus y anticuerpos contra el virus d e la Diarrea Viral bovina

4. Virus de FPC

Condiciones ambientales

De laboratorio, con temperatura óptima de 18 -26°C en área estéril.

Preparación y acondicionamiento de la muestra

La tonsila, ganglios submaxilares y bazo son los órganos de elección.

Deben conservarse en refrigeración y/o congelación en frascos o bolsas estériles con cierre

hermético.

Procedimiento

Cortar 1 a 2 g. de muestra, pasar a cajas de Petri y lavar 2 veces con PBS con antibiótico al 2%.

Posteriormente macerar en un mortero, agreg ando PBS o solución de EARLE estéril, hasta obtener una

pasta homogénea (dilución 1:10)

Pasar a un mortero Stenbrook para una segundo macerado.

Depositar la suspensión del macerado en tubos de centrífuga.

Centrifugar a 5000 rpm durante 15 minutos a tempera tura de 5°C.

Cosechar el sobrenadante y filtrar.

Inocular 100 microlitros del fluido centrifugado a las microplacas, dejando los pozos de las columnas

11 y 12, sin infectar como controles de células.

Inocular en la línea H de la microplaca el virus control positivo.

El fluido del macerado debe inocularse a una botella de cultivo, dejando una botella como control

celular.

Incubar las microplacas a 37°C con 5% de C02 por 48 o 72 horas.

El fluido de las microplacas se retira y se lavan con PBS, se secan y se f ijan con acetona al 30% con

albúmina sérica al .02% durante 10 a 15 minutos, secándolas posteriormente.

La botella se incuba 1 hora a 37°C y posteriormente se retira el inóculo, se lava con PBS y se

adiciona MEM, incubando 48 o 72 horas.

Las botellas inocu ladas se congelan a -70°C y después, se descongelan rápidamente.

El fluido se recolecta en tubos de centrífuga y se centrifuga a 3000 - 5000 rpm/15 -20 minutos.

Cosechar el sobrenadante, prosiguiendo con los puntos 5 y 9.

Filtrar. Inocular a microplacas. In ocular en la línea H de la microplaca el virus control positivo. Incubar.

Una vez secas las microplacas, preparar el suero hiperinmune de FPC en una dilución 1:10 y

depositar 50 microlitros en cada pozo e incubar 15 -20 minutos a 37°C.

Retirar el suero hipe rinmune y lavar las microplacas con (SAF L) 2 -3 veces.

Adicionar el conjugado a una dilución 1:500, depositando 50 ml a cada pozo de las placas e incubar

con las mismas condiciones del punto anterior.

Retirar conjugado y lavar con SAF-L 2-3 veces.

Adicionar el sustrato cromógeno, 50 ml/pozo, e incubar a medio ambiente 15 -20 minutos.

Retirar sustrato y lavar las placas con SAF -L 2 a 3 veces.

Secar y observar al microscopio invertido o microscopio óptico.

Interpretación de resultados

Cuando se observa tinción rojo ladrillo en el citoplasma y membrana de la línea celular, el resultado

se considera positivo, tal como se observa en el control positivo.

Indices de reproductibilidad y repetibilidad

Mayor al 95% si se sigue estrictamente el método descrito.