Numeral 14 — NOM-056-ZOO-1995, Especificaciones técnicas para las pruebas diagnósticas que realicen los laboratorios de pruebas aprobados en materia zoosanitaria.

14 Enfermedad de Aujeszky

Título

Sueroneutralización para detecció n de anticuerpos contra el virus de la Enfermedad de Aujeszky (EA).

Objetivo

Esta prueba se utiliza para cuantificar los anticuerpos contra el virus de la Enfermedad de Aujeszky,

en muestras de suero sanguíneo de porcinos que han estado en contacto con el virus.

Campo de aplicación

Esta prueba se utiliza para confirmar o descartar la presencia de anticuerpos en animales

vacunados, sospechosos o con signos clínicos de EA.

Documentos conexos a consultarse.

Norma Oficial Mexicana NOM-007-ZOO-1994, Campaña Naci onal contra la Enfermedad de Aujeszky.

Norma Oficial Mexicana NOM -003-ZOO-1994, Criterios para la operación de laboratorios de pruebas

aprobados en materia zoosanitaria.

Norma Oficial Mexicana NOM -029-ZOO-1995, Características y especificaciones para las

instalaciones y equipo de laboratorios de pruebas y/o análisis en materia zoosanitaria.

Generalidades

Determinar la presencia de anticuerpos específicos contra el virus de la EA, capaces de neutralizar la

acción infectante del virus de la EA a una concentra ción de 200 DICC 50%.

Equipo e instrumentos

1.- Agitador de microplacas.

2.- Baño María.

3.- Centrífuga clínica.

4.- Estufa de CO2.

5.- Microscopio de luz invertida.

6.- Multipipetas de 8 a 12 canales (50 -200 microlitros).

7.- Micropipetas de 50 -100 microlitros.

8.- Ultracongelador o termo con nitrógeno líquido

9.- Refrigerador con capacidad mínima de 9 pies cúbicos, con congelador integrado.

Materiales

1.- Gradillas.

2.- Microplacas de 96 pozos con fondo plano.

3.- Puntas para pipetas.

4.- Tubos de ensayo.

Reactivos

1.- Antibiótico (penicilina, estreptomicina o kanamicina al 1%).

2.- Bicarbonato de sodio en solución al 7%.

3.- L.E. (Earles con lactoalbúmina).

Biológicos

1.- Células PK15 (riñón de cerdo), SKL (línea de riñón de c erdo) o cualquier otra línea o cultivo al cual

esté adaptado el virus. Células en suspensión, pero se puede trabajar en monoestrato.

2.- Suero Fetal Bovino.

3.- Suero de porcino, testigo negativo.

4.- Suero de porcino testigo positivo.

5.- Virus de la Enfe rmedad de Aujeszky con título mínimo de 105 DICC 50%/ml, el cual se debe

conservar en congelación a -70°C o en nitrógeno líquido.

Condiciones ambientales

De laboratorio con temperatura óptima de 18 a 25°C.

Preparación y acondicionamiento de la muestra

- Centrifugar la muestra de suero a 1,500 rpm x 10 minutos.

- Transferir el suero a un tubo de ensayo e identificar.

- Inactivar a 56°C durante 30 minutos en Baño María.

- En caso de que la prueba se lleve a cabo el día siguiente de preparada la muestra, esta última debe

conservarse en congelación.

Procedimiento

En los dos primeros pozos de cada columna de una microplaca, depositar 50 microlitros del suero

problema. Las cantidades (50 microlitros) pueden variar y se pueden utilizar 25 microlitros.

- Agregar a todos los pozos de la microplaca, 50 microlitros de medio diluente (L.E.+1% de

bicarbonato de sodio).

- Hacer diluciones dobles a partir del 2o. pozo, quedando el primer pozo como control de suero, para

detectar si éste presenta toxicidad o alg una otra característica, que pueda interferir con la prueba.

- Agregar 50 microlitros de virus de E.A. ajustado a 200 DICC 50% (dosis infectantes de cultivo celular

50%) a cada pozo, excepto a los controles de suero.

- Incubar durante 1 hora a 37 °C.

- Aña dir 100 microlitros de células PK15 o equivalente y dejar en incubación de 48 a 72 horas,

revisando diariamente los controles.

Para el control de los biológicos utilizados, preparar en forma paralela otra microplaca con lo

siguiente:

- Virus origen "O" o v irus de trabajo, a partir del cual se harán 3 diluciones logarítmicas. Las que irán

en las hileras correspondientes a:

- Control de células: Depositar en las hileras 11 y 12 de la microplaca, 100 microlitros de células

PK15 o equivalente por pozo, para det ectar posibles alteraciones en las mismas.

- Control de virus: El virus se ajusta de acuerdo al título a 200 DICC 50%, a partir de lo cual efectuar

tres diluciones logarítmicas para asegurar que hay 200 dosis.

1 y 2: Virus de origen.

3 y 4: 10-1

5 y 6: 10-2

7 y 8: 10-3

- Control positivo: Utilizar un suero testigo positivo, con título conocido de anticuerpos contra E.A.

Colocar en la hilera número 9 de la microplaca.

- Control negativo: Emplear un suero testigo negativo a anticuerpos contra la E.A. y de positarlo en la

hilera número 10 de la microplaca.

Fórmulas de cálculo para resultados

En esta técnica no se utilizan.

Interpretación de resultados

1.- Control de células. - Observar que el monoestrato esté completo y que las células presenten una

morfologí a característica.

2.- Control positivo. - Observar que el monoestrato celular se encuentre completo, en virtud de que el

suero testigo positivo neutralizó al virus y evitó el efecto citopático.

3.- Control negativo.- Observar el efecto citopático producido por el virus, al no existir anticuerpos en el

suero testigo negativo.

La lectura se puede hacer más evidente, eliminando el medio diluente y añadiendo algún colorante

vital, como el azul de metileno, que tiñe únicamente a las células vivas.

Los resultados de esta prueba se expresan en forma cuantitativa, con base al título o cantidad de

anticuerpos neutralizantes que estén presentes en el suero problema.

Por lo tanto, los títulos serán cuantificados, a partir del primer pozo en el que se observe claramente

efecto citopático.

Es decir, si el efecto citopático se observó en el pozo con dilución de 1:32, el título será expresado

como 1:16, ya que en la siguiente dilución no neutralizaron el virus, por lo que este último provocó muerte

celular.

Indices de reprod ucibilidad y repetibilidad

Mayor a un 95% si se sigue literalmente el método descrito.