Apéndice A — NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos.

Apéndice A Normativo.

Método de referencia para el aislamiento de Salmonella spp.

Este método es aplicable para la detección de Salmonella spp en productos para consumo humano, así

como de áreas de producción y manejo de alimentos especialmente en productos dond e las condiciones

ambientales permiten la contaminación de estos productos por microorganismos de la familia

Enterobacteriaceae.

A.1 INTRODUCCIÓN.

Los miembros del género Salmonella spp han sido muy estudiados como patógenos cuando se

encuentran presentes en los alimentos. El control de este microorganismo depende en cierta medida del

método analítico utilizado para su detección.

Este microorganismo fue inicialmente identificado en muestras clínicas y los métodos empleados para

estos casos se adaptaron post eriormente para su detección en alimentos. Las modificaciones a los métodos

consideraron dos aspectos principales, el primero es el debilitamiento o daño a las células bacterianas

presentes en un alimento debido al proceso a que está sujeto (por ejemplo: t ratamiento térmico, secado, etc.)

y segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo estudio.

La determinación de la presencia o ausencia de Salmonella spp, en cierta cantidad de masa o volumen

específico de producto, se lleva a cabo ac orde a lo descrito en el presente método, requiriendo 4 etapas

sucesivas. Las cuales son:

- Etapa de pre-enriquecimiento;

- Enriquecimiento selectivo;

- Aislamiento en medios de cultivos selectivos y diferenciales, e

- Identificación bioquímica y confirmación serológica de los microorganismos.

Nota: Salmonellaspp puede presentarse en concentraciones bajas y en algunas ocasiones ir acompañada

de una gran cantidad de biota microbiana y de otras enterobacterias y otros géneros bacterianos. Es por lo

que se hac e necesario el pre -enriquecimiento para permitir la detección de un número bajo de bacterias o

células estresadas de Salmonella spp.

A.2 EQUIPO.

A.2.1 Autoclave;

A.2.2 Horno que alcance 180°C;

A.2.3 Incubadora capaz de operar a 36°C ± 1°C;

A.2.4 Baño de agua capaz de operar a 41.5°C ± 1°C o incubadora capaz de trabajar a 41.5°C ± 1°C;

A.2.5 Baño de agua capaz de operar a 45°C ± 2°C;

A.2.6 Baño de agua capaz de operar a 37°C ± 1°C;

A.2.7 Potenciómetro;

A.2.8 Balanza granataria con sensibilidad de 0.1g verificada el día de uso;

A.2.9 Homogeneizador peristáltico o licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con

vasos esterilizables (vidrio, aluminio o acero inoxidable);

A.2.10 Equipo de filtración con trampa, y

A.2.11 Bomba de vacío.

A.3 MATERIALES.

A.3.1 Asa de platino, níquel o desechables de aproximadamente 3mm de diámetro o 10L (microlitros);

A.3.2 Pipetas graduadas o pipetas automáticas, de diferentes capacidades 10mL, 5mL, graduadas

respectivamente en divisiones de 0.5mL y 0.1mL protegidas con tapón de algodón;

A.3.3 Pipetas de 1mL, con graduaciones de 0.1mL;

A.3.4 Matraces Erlenmeyer de 500mL y/o capacidad apropiada;

A.3.5 Cajas Petri estériles de vidrio o desechables de diámetro 15mm x 100mm y/o de un di ámetro mayor

a 140mm;

A.3.6 Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas;

A.3.7 Tubos de ensaye de 16mm x 150mm y de 20mm x 100mm o de capacidades adecuadas;

A.3.8 Gradillas para tubos de ensaye;

A.3.9 Mecheros Bunsen o Fisher;

A.3.10 Papel Indicador de pH;

A.3.11 Pinzas estériles para membrana;

A.3.12 Matraces Kitazato de 1000mL;

A.3.13 Filtros de membranas estériles de tamaño de poro de 0.45µm, y

A.3.14 Manguera de hule para equipo de filtración.

Nota: El material desechable puede utilizarse como alternativa a ceptable a la cristalería reutilizable si

cumple las especificaciones adecuadas.

A.4 MEDIOS DE CULTIVO.

A.4.1 Agua Peptonada amortiguada;

A.4.2 RVS;

A.4.3 MKTTn;

A.4.4 XLD;

A.4.5. EH;

A.4.6 ASB;

A.4.7 Agar Verde Brillante;

A.4.8 Agar nutritivo;

A.4.9 TSI;

A.4.10 LIA;

A.4.11 Agar Urea de Christensen;

A.4.12 Medio L-Lisina descarboxilasa;

A.4.13 Solución salina fisiológica;

A.4.14 Caldo Triptona al 1%;

A.4.15 CTT;

A.4.16 CST;

A.4.17 Caldo Nutritivo;

A.4.18 Caldo Dey-Engley;

A.4.19 Leche descremada, y

A.4.20 Caldo Lactosado.

A.5 REACTIVOS.

A.5.1 Reactivos para la reacción VP (α -naftol y KOH);

A.5.2 Reactivos para la reacción de indol. Reactivo de Kovac o Erlich;

A.5.3 Antisuero somático (O) polivalente de Salmonella spp;

A.5.4 Tolueno;

A.5.5 -naftol;

A.5.6 Solución de creatina;

A.5.7 KOH;

A.5.8 Salmonella Typhimurium ATCC 14028 (S.Typhimurium);

A.5.9 Salmonella diarizonae ATCC 12325. (S. diarizonae);

A.5.10 Salmonella abortus equi ATCC 9842. (S. abortus equi);

A.5.11 ONPG;

A.5.12 Novobiocina (sal sódica);

A.5.13 Yodo;

A.5.14 Yoduro de Potasio;

A.5.15 Alcohol etílico 96%;

A.5.16 4-Dimetilaminobenzaldehído;

A.5.17 HCI, r = 1.18g/mL a 1.19g/mL;

A.5.18 2-metilbutan-2-ol;

A.5.19 Cloruro de sodio;

A.5.20 Monohidrato de creatina;

A.5.21 Solución acuosa de verde brillante al 1%;

A.5.22 Tergitol/Aniónico;

A.5.23 Triton X-100;

A.5.24 NaOH 1N;

A.5.25 Alcohol al 70%;

A.5.26 Sulfato Ferroso, y

A.5.27 K2 SO3 Sulfato de Potasio.

A.6 CONDICIONES DE PRUEBA.

A.6.1 Muestreo.

Es importante que el laboratorio se cerciore de recibir una muestra representativa y que no ha ya tenido

daños o cambios durante el transporte y/o almacenamiento.

El muestreo no es parte del método especificado aquí, es recomendable que las partes involucradas en

este punto lleguen a un acuerdo al respecto, pueden utilizarse diversos estándares inte rnacionales tales como

los planes de muestreo del CODEX alimentarios o las guías del ICMSF.

A.6.2 Preparación de la muestra de ensayo.

Lineamientos generales para la preparación de las muestras.

A.6.2.1 General.

La preparación de la suspensión inicial requ iere 25g de la muestra en 225mL del medio de pre-

enriquecimiento, para obtener una dilución 1:10.

En una situación atípica y justificada, si la porción de muestra utilizada en el ensayo es distinta a 25g, se

deberá utilizar la cantidad necesaria de medio de pre-enriquecimiento para obtener una dilución 1:10.

En casos excepcionales, cuando es necesario analizar más de una porción de 25g de un lote específico

de alimento y teniendo evidencia de que si hay mezcla de tales porciones no afecta el resultado, las muestras

pueden ser compuestas; es decir, si 10 muestras de 25g serán examinadas, combinar las 10 porciones para

obtener 250g y adicionar 2.25L del caldo de pre-enriquecimiento precalentado a 36°C ± 1°C.

Sin embargo, se debe tomar en cuenta que para inocul ar el caldo selectivo RVS y MKTTn aumentarán las

porciones de 10mL a 100mL teniendo que inocular 1mL y 10mL respectivamente. Continuar como se indica

en el punto A.7.2.

A.6.2.2 Productos que contienen cacao.

Agregar al agua peptonada amortiguada 50g/L de c aseína (no usar caseína ácida) o 100g/L de leche

descremada en polvo, incubar a 36°C ± 1°C por 2h, añadir 0.018g/L de verde brillante. Continuar como se

indica en el punto A.7.

A.6.2.3 Productos ácidos y acidificantes.

Asegurarse de que el pH no se encuent re por debajo de 4.5 durante el pre -enriquecimiento, puede

utilizarse agua peptonada amortiguada a doble concentración. En caso de que se requiera subir el pH a más

de 4.5 utilizando NaOH 1N, registrar esta cantidad para alcanzar un pH entre 5 y 7. Continu ar como se indica

en el punto A.7.

A.6.2.4 Preparación de la muestra para moluscos en concha.

En general, deben tomarse un mínimo de 10 a 12 moluscos bivalvos, a fin de obtener una muestra

representativa y permitir la selección de animales completos dispon ibles para su desconche. Con la mayoría

de las especies, esto permite una adecuada selección y se obtendrán aproximadamente 200g de licor y carne.

Por otro lado diez a doce piezas de ciertas especies pequeñas de moluscos bivalvos, pueden producir mucho

menos que 100g de licor y carne por lo que se deben usar de veinte piezas a treinta piezas de estas especies

para obtener el peso adecuado.

Limpieza de la concha. Lavarse las manos con agua potable y jabón antes de comenzar. Enjuagar el

exceso de suciedad de las conchas y cepillar con un cepillo estéril, ocupando uno para la muestra completa;

bajo el chorro de agua potable poniendo particular atención en las hendiduras de las conchas. Colocar las

conchas limpias en toallas de papel absorbente o gasas limpias. Desechar los moluscos que tengan las

conchas dañadas o con las valvas abiertas.

Remoción del contenido. Lavarse las manos con agua, jabón y enjuagarse con alcohol al 70%. Se puede

utilizar guantes para evitar lesionarse. Sostener el molusco en la mano sobr e una gasa dirigiendo la unión de

las valvas o bisagra hacia el analista apoyándose sobre la mesa. Con un cuchillo desconchador estéril,

insertar la punta entre las valvas y hacer palanca para cortar el músculo abductor. Drenar el licor de la concha

dentro de un recipiente estéril. Cortar el músculo abductor de las conchas y vaciar el cuerpo del animal dentro

del mismo recipiente. Continuar como se indica en el punto A.6.2.5

A.6.2.5 Procedimiento para moluscos, desconchados y congelados.

Pesar el total de l a muestra, máximo 200g (carne y licor) y adicionar igual cantidad de agua peptonada

amortiguada para obtener una dilución 1:2. Licuar por 2 min. Continuar como se indica en el punto A.7.

A.6.2.6 Yema de huevo en polvo, clara de huevo en polvo, huevo en pol vo, leche fluida, leche

descremada, leche con 2% de grasa, entera y suero de leche. Mezclas preparadas en polvo (Harinas

para pastel, galletas, donas, b ísquets y pan) Fórmulas infantiles y alimentos para administración por

cánula u oral, que contengan huevo. Si las muestras no están en polvo, agregar 225mL de agua peptonada

amortiguada. Si el producto es un polvo, agregar aproximadamente 15mL de agua peptonada y agitar con una

varilla de vidrio, cuchara o abate lenguas, hasta obtener una suspensión homogéne a. Agregar tres porciones

más de 10mL, 10mL y 190mL para un total de 225mL. Agitar suficientemente hasta que la suspensión no

contenga grumos. Tapar el frasco y dejar en reposo durante 60 min ± 5 min a temperatura del laboratorio

promedio que oscila entre 18°C y 27°C. Mezclar por agitación, aflojar la tapa a 1/4 de vuelta, e incubar a 36°C

± 1°C 18h ± 2h. Continuar como se indica en el punto A.7.2..

A.6.2.7 Huevos.

A.6.2.7.1 Huevo en cascarón. Eliminar cualquier material ajeno adherido a la superficie del c ascarón.

Desinfección del cascarón: Preparar la solución desinfectante (1:3) que consiste en adicionar tres partes de

una solución de etanol o isopropanol al 70% a una parte de solución de yodo/yoduro de potasio. Preparar una

solución de alcohol al 70% dil uyendo 700mL de etanol al 100% hasta completar un volumen final de 1000mL

de agua destilada estéril o bien diluir 700mL de alcohol al 95% con agua destilada estéril hasta completar un

volumen final de 950mL. La solución de yodo/yoduro de potasio se prepara como sigue: Pesar 100g de

yoduro de potasio y disolver en 200mL -300mL de agua destilada estéril. Adicionar 50g de yodo y calentar

suavemente con agitación constante hasta disolver el yodo. Disolver esta solución hasta completar un

volumen final de 1000mL de agua destilada estéril y almacenar en una botella ámbar con tapón de vidrio en la

oscuridad. Sumergir los huevos en esta solución por al menos 10s, sacarlos y dejar secar al aire. Cada

muestra consiste de 20 huevos, en un total de 50 muestras por cada g allinero. Abrir los huevos en

condiciones asépticas con guantes estériles y pasar a un recipiente estéril, cambiar guantes entre cada

muestra. Evitar que fragmentos del cascarón caigan en el contenedor. Mezclar completamente las yemas y

claras con una cuch ara o cualquier otro instrumento estéril. Mantener las muestras a temperatura ambiente

(20°C-24°C) por 96h ± 2h. Después de este tiempo, tomar 25mL o 25g de la mezcla anterior y 25mL de un

CST de prueba (testigo) en un contenedor de 500mL y agregar 225mL d e CST suplementado con sulfato

ferroso (35mg de sulfato ferroso a 1000mL de CST). Mezclar bien por agitación. Dejar en reposo durante 60

min ± 5min a temperatura ambiente. Mezclar nuevamente por agitación y determinar pH con papel indicador.

Ajustar el pH, si es necesario, a 6.8 ± 0.2. Incubar 24h ± 2h a 36°C ± 1°C. Continuar como se indica en el

punto A.7.2.

A.6.2.7.2 Huevo entero líquido (homogeneizado). Combinar 15 porciones de 25mL cada una para dar

una muestra combinada de 375mL en un matraz Erlenmeyer de 6L. Mantener esta mezcla a temperatura

ambiente (20°C -25°C) por 96h ± 2h. Después de este tiempo, adicionar 3375mL de CST suplementado con

sulfato ferroso. Mezclar bien por agitación. Dejar en reposo durante 60 min ± 5 min a temperatura ambiente.

Mezclar nuevamente por agitación y determinar pH con papel indicador. Ajustar el pH, si es necesario, a 6.8 ±

0.2. Incubar 24h ± 2h a 36°C ± 1°C. Continuar como se indica en el punto A.7.2.

A.6.2.7.3 Huevo cocido o hervido (de pollo, pato u otros). Si el casca rón del huevo se encuentra

intacto, desinfectar como se describe en el inciso A.6.2.7.1 y separar en condiciones asépticas el cascarón.

Pulverizar la yema y la clara y pesar 25g en un matraz Erlenmeyer de 500mL u otro recipiente apropiado.

Agregar 225mL CST (sin sulfato ferroso). Mezclar bien por agitación y continuar como se describe para huevo

en cascarón. Continuar como se indica en el punto A.7.2.

A.6.2.8 Leche descremada en polvo y Caseína. Pesar 50g de producto en 1L de agua peptonada

amortiguada, incubar a 36°C ± 1°C por 24h ± 2h, después de 2h de incubación, adicionar 2mL de solución

verde brillante 1% si el alimento tiene alta probabilidad de estar contaminado con microbiota Gram Positivo.

Incubar durante 18h ± 2h a 36°C ± 1°C. Continuar como se indica en el punto A.7.2.

A.6.2.9 Productos que contienen huevo (pastas, rollos de huevo, macarrones, espagueti), quesos,

ensaladas preparadas a base de: jamón, huevo, pollo, atún, pavo; frutas y verduras frescas

congeladas o secas; frutas secas, carne, crust áceos (camarones, cangrejo, cangrejo de río, langosta,

langostinos) y pescado. De preferencia, no descongelar muestras congeladas, antes de someterlas al

análisis. Si la muestra está congelada para obtener una submuestra para el análisis, descongelar en un baño

de agua con temperatura controlada y flujo continuo a 45°C ± 0.2°C durante 15min, o mantener la muestra

durante 18h de 2°C -5°C. Pesar en condiciones asépticas, 25g de muestra en un vaso de licuadora. Agregar

225mL de agua peptonada amortiguada y licu ar por 2 min. Pasar a un frasco estéril de boca ancha y tapa de

rosca de 500mL. Mezclar por agitación, aflojar la tapa a 1/4 de vuelta e incubar durante 18h ± 2h a 36°C ±

1°C. Continuar como se indica en el punto A.7.2.

A.6.2.10 Levadura seca (levadura act iva e inactiva). Pesar en condiciones asépticas, 25g de muestra,

en un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca de 500mL. Agregar 225mL de CST. Mezclar bien hasta

formar una suspensión homogénea. Dejar en reposo, a la temperatura del laboratorio, duran te 60 min ± 5 min,

con la tapa bien cerrada. Mezclar bien por agitación y determinar pH con papel indicador. Ajustar el pH si es

necesario, a 6.8 ± 0.2. Mezclar bien antes de ajustar el pH final. Aflojar la tapa a 1/4 de vuelta e incubar

durante 24h ± 2h a 36°C ± 1°C. Continuar como se indica en el punto A.7.2.

A.6.2.11 Mezclas para repostería o cremas pasteleras. Pesar en condiciones asépticas, 25g de

muestra, en un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca, de 500mL. Agregar 225mL de caldo nutritivo y

mezclar bien. Dejar en reposo a la temperatura del laboratorio, durante 60 min ± 5 min, con la tapa bien

cerrada. Ajustar el pH si es necesario, a 6.8 ± 0.2 mezclar bien, antes de ajustar el pH final. Aflojar la tapa a

1/4 de vuelta e incubar durante 24h ± 2h a 36°C ± 1°C. Continuar como se indica en el punto A.7.2.

A.6.2.12 Especias.

A.6.2.12.1 Pimienta negra, pimienta blanca, semillas de apio en hojuelas, chile en polvo, cominos,

páprika, hojuelas de perejil, romero, semilla de ajonjolí, tomillo y yerbas en hojuelas. Pesar en

condiciones asépticas, 25g de muestra, en un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca de 500mL. Agregar

225mL de CST. Mezclar bien. Dejar en reposo con la tapa bien cerrada, durante 60 min ± 5 min a temperatura

de laboratorio. Mezclar bien por agitación y determinar pH con papel indicador. Ajustar el pH si es necesario, a

6.8 ± 0.2. Mezclar bien, antes de ajustar el pH final. Aflojar la tapa a 1/4 de vuelta e incubar durante 24h ± 2h a

36°C ± 1°C. Continuar como se indica en el punto A.7.2.

A.6.2.12.2 Cebolla en hojuelas, cebolla en polvo, ajo en hojuelas. Pesar en condiciones asépticas, 25g

de muestra, en un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca, de 500mL. Pre -enriquecer la muestra en CST

adicionado con K2SO3 (5g K2SO3 por 1000mL de CST, resultando una concentración final de 0.5% de K 2SO3).

Agregar el K 2SO3 al caldo antes de esterilizar, distribuir en volúmenes de 225mL en matraces Erlenmeyer de

500mL esterilizar a 121°C por 15 min. Después de esterilizar, determinar el pH as épticamente, ajustando de 5

a 7. Incubar a 36°C ± 1°C durante 24h ± 2h. Continuar como se indica en el punto A.7.2.

A.6.2.12.3 Pimienta de Jamaica, canela, clavo y orégano. Hasta ahora, no se conocen métodos para

neutralizar la toxicidad de estas cuatro es pecias. Lo que se recomienda para su análisis, es diluirlas más allá

de su nivel tóxico. En el caso de la pimienta de Jamaica, canela y orégano; preparar diluciones con una

relación 1:100 muestra/CST; y para el clavo, una relación 1:1000. En el caso de con dimentos en hojas secas,

preparar diluciones cuya relación sea mayor a 1:10, debido a las dificultades que se han encontrado para que

el caldo se absorba en productos deshidratados. Analizar estas especias como se describe para la pimienta

negra, mantenien do las relaciones muestra/CST, recomendadas. Incubar a 36°C ± 1°C durante 24h ± 2h.

Continuar como se indica en el punto en A.7.2.

A.6.2.13 Dulce, cubierta de dulce (incluyendo chocolate). Pesar en condiciones asépticas, 25g de

muestra en un vaso de licuad ora u homogeneizador peristáltico tipo Stomacher. Agregar 225mL de leche

descremada, reconstituida, estéril y licuar por 2 min. Pasar la mezcla homogeneizada a un frasco de boca

ancha, con tapón de rosca de 500mL y dejar en reposo durante 60min ± 5min, con la tapa bien cerrada, a

temperatura del laboratorio. Mezclar bien por agitación y determinar pH con papel indicador y/o potenciómetro.

Ajustar el pH si es necesario a 6.8 ± 0.2. Agregar 0.45mL de solución acuosa de verde brillante al 1% y

mezclar bien. Af lojar la tapa a 1/4 de vuelta e incubar durante 24h ± 2h a 36°C ± 1°C. Continuar como se

indica en el punto A.7.2.

A.6.2.14 Coco. Pesar, en condiciones asépticas, 25g de muestra, en un frasco estéril de boca ancha y

tapa de rosca, de 500mL o cualquier otro recipiente adecuado. Agregar 225mL de caldo lactosado estéril.

Agitar bien y dejar en reposo a la temperatura del laboratorio durante 60min ± 5min, con la tapa bien cerrada.

Mezclar bien por agitación y determinar pH con papel indicador. Ajustar el pH si es necesario, a 6.8 ± 0.2.

Agregar hasta 2.25mL de Tergitol/Aniónico (pasado por vapor fluente durante 15min) y mezclar bien.

Alternativamente se puede usar Triton X -100 (pasado por vapor fluente durante 15min). Limitar el uso de

estos surfactantes a la cantidad mínima necesaria para evitar la formación de espuma. En el caso de Triton X-

100, con dos gotas a tres gotas es suficiente. Aflojar la tapa a 1/4 de vuelta e incubar durante 24h ± 2h a 36°C

± 1°C. Continuar como se indica en el punto A.7.2.

A.6.2.15 Colorantes y substancias coloridas para alimentos. En el caso de colorantes con pH mayor a

6.0 (suspensiones acuosas al 10%), aplicar el método descrito para huevo entero desecado.

A.6.2.16 Colorante (lacas) o colorantes con pH abajo de 6.0. Pesar en condi ciones asépticas, 25g de

muestra en un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca de 500mL o cualquier otro recipiente adecuado.

Agregar 225mL de CTT sin verde brillante. Mezclar bien por agitación y determinar pH con papel indicador.

Ajustar el pH. Agit ar bien y dejar en reposo a la temperatura ambiente durante 60 min ± 5 min, con la tapa

bien cerrada. Ajustar el pH a 6.8 ± 0.2 y agregar 2.25mL de solución al 0.1% de verde brillante mezclar

completamente, por agitación. Aflojar la tapa a 1/4 de vuelta e incubar durante 24h ± 2h a 36°C ± 1°C.

Continuar como se indica en el punto A.7.2.

A.6.2.17 Gelatina. Pesar, en condiciones asépticas, 25g de muestra, en un frasco estéril de boca ancha y

tapa de rosca, de 500mL o cualquier otro recipiente adecuado. Agrega r 225mL de agua peptonada

amortiguada estéril, agregar 5mL de solución acuosa de papaína al 5% y mezclar bien. Colocar la tapa bien

cerrada e incubar a 36°C ± 1°C por 60 min ± 5 min. Mezclar bien y aflojar la tapa a 1/4 de vuelta e incubar

durante 18h ± 2h a 36°C ± 1°C. Continuar como se indica en el punto A.7.2.

A.6.2.18 Carnes, substitutos de carne, productos cárnicos, sustancias de origen animal, glándulas

y otros alimentos (pescado, carne y hueso). Pesar, en condiciones asépticas, 25g de muestra, en un vaso

de licuadora. Agregar 225mL de agua peptonada amortiguada estéril y licuar por 2min. Aflojar la tapa a 1/4 de

vuelta e incubar durante 24h ± 2h a 36°C ± 1°C. Continuar como se indica en el punto A.7.2.

A.6.2.19 Ancas de rana. Colocar 15 pares de ancas de rana en una bolsa de plástico estéril y cubrirlas

con agua peptonada amortiguada en una proporción 1:9 muestra/caldo (g/mL). Si se estima que un solo par

de ancas, pesa un promedio de 25g o más, analizar un solo par, por cada 15 pares. Colocar la bolsa en un

vaso de plástico grande o cualquier otro recipiente. Incubar a 36°C ± 1°C por 18h ± 2h. Continuar el análisis,

como se indica en el punto A.7.2.

A.6.2.20 Conejo en canal. Introducir el conejo en una bolsa de plástico estéril y colocarlo en un vaso u

otro contenedor de tamaño suficiente para sumergir la canal. Adicionar agua peptonada amortiguada en una

proporción 1:9 muestra/caldo (g/mL) para cubrir la muestra. Mezclar bien con agitación. Incubar a 36°C ± 1°C

por 18h ± 2h. Continuar el análisis como se indica en el punto A.7.2

A.6.2.21 Jugo de naranja (pasteurizado y sin pasteurizar), jugo de manzana (pasteurizado y sin

pasteurizar). En condiciones asépticas, agregar 25mL de la muestra y 225mL de agua peptonada

amortiguada, en un frasco de boca ancha estéril, con tapa de rosca de 500mL u otro recipiente apropiado.

Agitar para mezclar completamente. Incubar con la tapa suelta por 18h ± 2h a 36°C ± 1°C. Continuar como se

indica en el punto A.7.2.

A.6.2.22 Orejas de puerco. Colocar en un bolsa de plástico una pieza (de dos a tres pi ezas si éstas son

pequeñas) por cada unidad analítica. Introducir la bolsa en un vaso o en un contenedor adecuado. Adicionar

agua peptonada amortiguada en una proporción 1:9 de muestra/caldo (g/mL) para cubrir las piezas. Mezcla r

bien con agitación e incubar a 36°C ± 1°C por 18h ± 2h. Continuar como se indica en el punto A.7.2.

A.6.2.23 Melones. Preferentemente no descongelar las muestras antes del análisis. Si la muestra está

congelada atemperar las muestras para obtener la porc ión analítica. Descongelar en un baño de agua con

temperatura controlada con termostato, a 45°C ± 0.2°C durante 15 min y con agitación constante, o

descongelar manteniendo la muestra a 2°C -5ºC durante 18h. Para la fruta picada o cortada, pesar 25g en

condiciones asépticas en un vaso de licuadora. Adicionar 225mL de agua peptonada amortiguada estéril y

licuar por 2 min. Pasar el homogeneizado a un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca, de 500mL o

cualquier otro recipiente adecuado. Aflojar la tapa e i ncubar a 36°C ± 1°C por 18h ± 2h. Continuar como se

indica en el punto A.7.2.

A.6.2.24 Para melones enteros. No enjuagarlos aun si presentan tierra o suciedad visible. Analizarlos

como estén. Colocar los melones en una bolsa de plástico estéril. Agregar su ficiente agua peptonada

amortiguada que permita que el melón flote. El volumen del agua peptonada amortiguada puede ser una y

media veces el peso del melón. Por ejemplo los melones pesan 1500g probablemente se necesitará un

volumen de aproximadamente 2250m L de agua peptonada amortiguada. Adicionar más agua peptonada

amortiguada si es necesario. Colocar la bolsa de plástico con los melones y el agua en un vaso u otro

contenedor de tamaño suficiente para sumergir los melones. Doblar el extremo de la bolsa de plástico de

forma segura pero no apretada para que permita el paso de aire durante la incubación. Incubar abriendo

ligeramente la bolsa a 36°C ± 1°C por 18h ± 2 h. Continuar como se indica en el punto A.7.2

A.6.2.25 Mangos. De preferencia, no descongelar las muestras antes de su análisis. Si están congeladas,

atemperar las muestras para obtener la porción analítica. Descongelar en un baño de agua con temperatura

controlada y termostato, a 45°C ± 0.2°C durante 15 min y con agitación constante, o descongelar manteniendo

la muestra a 2°C -5ºC durante 18h. Para la fruta picada o cortada, pesar 25g en condiciones asépticas en un

vaso de licuadora. Adicionar 225mL de agua peptonada amortiguada estéril y licuar por 2 min. En condiciones

asépticas, pasar el homogenei zado a un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca, de 500mL o cualquier

otro recipiente de tamaño suficiente para sumergir los mangos. Aflojar la tapa 1/4 de vuelta e incubar a 36°C ±

1°C por 18h ± 2h. Continuar como se indica en el punto A.7.2.

A.6.2.26 Para mangos enteros. No enjuagarlos aun si presentan tierra o suciedad visible. Analizarlos

como estén. Colocar el mango en una bolsa de plástico estéril. Agregar suficiente agua peptonada

amortiguada que permita que el mango flote. El volumen del agua peptonada amortiguada puede ser una vez

el peso los mangos. Por ejemplo los mangos pesan 500g, probablemente se necesitará un volumen de

aproximadamente 500mL de agua peptonada amortiguada para que floten. Adicionar más agua peptonada

amortiguada si es ne cesario. Colocar la bolsa de plástico con los mangos y el agua peptonada amortiguada

en un vaso u otro contenedor de 5L. Incubar abriendo ligeramente la bolsa a 36°C ± 1°C por 18h ± 2h.

Continuar como se indica en el punto A.7.2

A.6.2.27 Tomates (tomates rojos o jitomates). Para la fruta picada o cortada, pesar 25g en condiciones

asépticas en un vaso de licuadora. Adicionar 225mL de agua peptonada amortiguada estéril y licuar por 2 min.

En condiciones asépticas, pasar el homogeneizado a un frasco estéril de boca ancha y tapa de rosca, de

500mL o cualquier otro recipiente de tamaño adecuado para sumergir los tomates. Aflojar la tapa a 1/4 de

vuelta e incubar durante 18h ± 2h a 36°C ± 1°C. Continuar como se indica en A.7.2.

A.6.2.28 Para tomates enteros. No en juagarlos aun si presentan tierra o suciedad visible. Analizarlos

como estén. Colocar los tomates en una bolsa de plástico estéril. Agregar suficiente agua peptonada

amortiguada que permita que los tomates floten. El volumen del agua peptonada amortiguada puede ser una

vez el peso de los tomates. Por ejemplo los tomates pesan 300g probablemente se necesitará un volumen de

aproximadamente 300mL de agua peptonada amortiguada. Adicionar más agua peptonada amortiguada si es

necesario. Colocar la bolsa de plásti co con los tomates y el caldo en un vaso u otro contenedor adecuado.

Doblar el extremo de la bolsa de plástico de forma segura pero no apretada para que permita el paso de aire

durante la incubación. Incubar abriendo ligeramente la bolsa a 36°C ± 1°C por 1 8h ± 2h. Continuar como en el

punto A.7.2.

A.6.2.29 Muestras ambientales. Muestrear superficies ambientales con hisopos o esponjas estériles.

Colocarlos en una bolsa estéril que contenga suficiente caldo Dey -Engley o solución de fosfatos para cubrir

los hisopos o esponja. Transportar las muestras protegidas en un contenedor con paquetes de gel congelado

para mantener las muestras frías, pero no congeladas. Si las muestras no pueden ser procesadas

inmediatamente, refrigerarlas a 4°C ± 2°C. Analizar las muest ras dentro de las siguientes 48h ± 2h después

de haber sido muestreadas, agregar a la bolsa o contenedor que contiene los hisopos o esponjas 225mL de

agua peptonada amortiguada estéril. Agitar bien el contenido. Cerrar el contenedor, mezclar, por movimient os

circulares vigorosos, mantener a temperatura ambiente por 60 min ± 5 min. Mezclar con movimientos

circulares y medir el pH con papel indicador, cuando sea necesario ajustar el pH a 6.8 ± 0.2, aflojar la tapa o la

boca de la bolsa e incubar durante 18h ± 2h a 36°C ± 1°C. Continuar como se indica en el punto A.7.2.

A.6.2.30 Semillas de alfalfa y frijoles. En condiciones asépticas pesar 25g de semillas de alfalfa y frijoles

en un matraz Erlenmeyer. Adicionar 225mL de agua peptonada amortiguada agitar el mat raz. Cubrir la boca

del matraz con papel aluminio estéril. Incubar a 36°C ± 1°C durante 18h ± 2h. Continuar como se indica en el

punto A.7.2.

A.6.2.31 Agua para consumo humano. Debido a que el agua para consumo humano pasa por procesos

de potabilización y purificación, los niveles de microorganismos viables son bajos, por lo que es necesario

utilizar métodos de concentración.

A.6.2.31.1 Filtración por membrana. Este método es recomendable para aguas con baja turbiedad.

Filtrar 1L o más de la muestra de agua . Retirar la membrana y colocarla en 50mL de agua peptonada

amortiguada. Incubar a 36°C ± 1°C por 18h ± 2h. Continuar como se describe en el punto A.7.2.

Nota: Para porciones grandes de agua peptonada amortiguada precalentar a 36°C ± 1°C antes de la

inoculación de la muestra a analizar.

A.7 PROCEDIMIENTO ANALÍTICO.

A.7.1 Pre-enriquecimiento.

En caso de uso general utilizar como medio de pre -enriquecimiento agua peptonada amortiguada incubar

la dilución inicial a 36°C ± 1°C por 18h ± 2h.

Para moluscos en con cha, desconchados y congelados. Inocular a temperatura ambiente 50g del

homogenizado (dilución 1:2) a 200mL de agua peptonada amortiguada e incubar a 36°C ± 1°C por 18h ± 2h.

A.7.2 Enriquecimiento selectivo.

Transferir 0.1mL del cultivo de pre -enriquecimiento a un tubo del 10mL de caldo RVS y 1mL a un tubo

conteniendo 10mL de caldo MKTTn.

Incubar el caldo RVS a 41.5°C ± 1°C por 24h ± 3h y el caldo MKTTn a 36°C ± 1°C por 24h ± 3h.

A.7.3 Aislamiento e identificación.

Para el aislamiento, inocular a partir de los cultivos obtenidos en el punto anterior, 3 medios selectivos en

placa como sigue:

Agar XLD para el aislamiento de colonias típicas y ASB para aislamiento de colonias lactosa positivas y

cualquier otro medio selectivo sólido complementario. El laborator io puede seleccionar que medio utilizar. Por

ejemplo, se pueden elegir el EH, Agar Verde Brillante, entre otros incluidos agares cromogénicos.

El agar XLD se incuba a 36°C ± 1°C durante 24h ± 3h, el segundo y tercer agar selectivo incubar de

acuerdo a las recomendaciones contenidas en los manuales de medios de cultivo de los fabricantes.

A.7.3.1 Morfología Colonial Típica de Salmonella spp.

Seleccionar 1 o más colonias de Salmonella spp de acuerdo con las características siguientes, en cada

agar selectivo:

A.7.3.1.1 XLD. Colonias rosas con o sin centro negro. Muchos cultivos de Salmonella spp pueden producir

colonias con un centro negro muy grande o completamente negras.

A.7.3.1.2 EH. Colonias azul-verdes o azules, con o sin centro negro. Muchos cultivos de Salmonella spp

pueden producir colonias con un centro negro muy grande o completamente negras, después de haber sido

incubadas a 36°C ± 1°C durante 24h ± 3h.

A.7.3.1.3 ASB. Colonias cafés, grises o negras; algunas veces pueden presentar brillo metálico y e l medio

circundante a la colonia generalmente es café al principio y a medida que se prolonga el tiempo de

incubación, pueden aparecer de color negro. Después de haber sido incubadas a 36°C ± 1°C durante 24h ±

3h o hasta 48h.

A.7.3.1.4 Agar VB. Colonias incoloras rosadas o fiusha, transparentes u opacas, sobre el medio coloreado

de rosado a rojo, las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.

Si se presentan colonias típicas en ASB después de 24h ± 2h de incubación, seleccionar al menos 1

colonia. Si por el contrario, no se observan colonias típicas a las 24h ± 2h, re -incubar las placas de ASB, otras

24h ± 3h. Después de 48h ± 2h de incubación, seleccionar si están presentes, al menos 1 colonia típica. Si las

colonias seleccionadas, no dan reacciones típicas en TSI y LIA, el cultivo se considera como negativo a

Salmonella spp.

A.7.3.2 Morfología Colonial Atípica de Salmonella spp.

En ausencia de colonias típicas sospechosas de Salmonella spp, buscar colonias atípicas con las

características siguientes:

A.7.3.2.1 Agares EH y XLD. Muy pocos cultivos atípicos de Salmonella spp, producen colonias rosa

salmón o amarillas respectivamente con o sin centro negro. En ausencia de colonias típicas, en EH y XLD,

seleccionar 2 o más colonias atípicas.

Nota: Existen algunas cepas de Salmonella spp con un comportamiento bioquímico diferente al resto del

género, por ejemplo S. Paratyphi A al crecer en XLD genera colonias rosas con el centro más obscuro y no

produce H2S. Otras salmonelas atípicas producen ácido a partir de la lactosa y al crecer en XLD dan colonias

amarillas con o sin el centro negro.

A.7.3.2.2 ASB. Algunos cultivos producen colonias verdes con un halo oscuro muy pequeño. Si después

de 48h de incubación (como se explicó anteriormente), no hay colonias típicas sospechosas en ASB,

seleccionar 2 o más colonias atípicas.

A.7.3.3 Cultivos Control Sugeridos.

Además de los cultivos control positivos ( Salmonella Typhimurium ATCC14028), deben usarse controles

adicionales para ayudar a la selección de co lonias atípicas, se recomiendan: S. diarizonae (ATCC 12325)

lactosa positivo, H 2S positivo y S. abortus equi (ATCC 9842), lactosa-negativo, H2S-negativo; o S. diarizonae

(ATCC 29934) lactosa-positivo, H2S-negativo.

A.7.3.4 Selección de colonias para su confirmación.

Para la confirmación, tomar de cada agar selectivo al menos 1 colonia considerada como típica o en total 3

colonias sospechosas si no existe la primera posibilidad.

En casos epidemiológicos, identificar al menos 5 colonias sospechosas, si en una placa se encuentran

menos de 5 colonias típicas o sospechosas, confirmar todas las colonias que se encuentren en el medio.

Estriar cada colonia seleccionada en cualquier agar nutritivo, preferiblemente sin agua de condensación,

de tal manera que permita el aislamiento de colonias. Incubar las placas inoculadas a 36°C ± 1°C durante 24h

± 3h.

Utilizar cultivos puros para la confirmación por pruebas bioquímicas y serología.

A.7.3.5 Confirmación Bioquímica.

A partir del agar nutritivo, con un asa recta estéril , tocar ligeramente el centro de la colonia seleccionada e

inocular en tubos de agar inclinado de TSI y LIA. Sembrar por picadura en el fondo y estría en la superficie

inclinada. Debido a que la reacción de descarboxilación de la lisina, es estrictamente a naerobia, el fondo del

medio de LIA, debe medir 4cm y el bisel de al menos 2.5cm.

Mantener las placas de agares selectivos y nutritivos entre 2°C-8ºC, hasta la conclusión del análisis.

Incubar los tubos de TSI y LIA a 36°C ± 1°C por 24h ± 3h. Dejar los tap ones flojos de los tubos para

mantener condiciones de aerobiosis mientras se incuban evitando excesiva producción de H 2S. Interpretar los

cambios de color como se describe a continuación:

TSI: Fondo del medio;

 Amarillo, glucosa positiva.

 Rojo o sin cambio de color, glucosa negativa.

 Negro, formación de sulfuro de hidrógeno.

 Burbujas o grietas en el medio, formación de gas debido a la utilización de la glucosa.

TSI: Superficie inclinada.

 Amarillo, lactosa y/o sacarosa positivos.

 Rojo o sin cambio de color, lactosa y/o sacarosa negativa.

Las colonias típicas de Salmonella spp, producen alcalinidad (color rojo) en la parte inclinada del medio y

ácido (color amarillo) en el fondo; con producción de gas y cerca del 90% de los casos producen H 2S

(ennegrecimiento del agar). Cuando alguna Salmonella spp lactosa positiva es aislada, el agar de TSI se torna

completamente amarillo.

En LIA, Salmonella spp produce reacción alcalina (color púrpura) considerar como negativos los cultivos

que produzcan claramente un color am arillo en el fondo del tubo. La mayoría de los cultivos de Salmonella

spp producen H2S en LIA.

Todos los cultivos que den reacción alcalina en el fondo del medio de LIA, independientemente de la

reacción que hayan dado en TSI, deben retenerse como aislamie ntos presuntivos de Salmonella spp, para

someterlos a pruebas bioquímicas adicionales y pruebas serológicas.

Para los cultivos de TSI que se consideran presuntivos para Salmonella spp, continuar como se indica en

Identificación de Salmonella spp para determinar la especie, incluyendo Salmonella arizonae.

a) Prueba de ureasa (convencional).

Con un asa estéril inocular tubos de agar urea de Christensen. Debido a que algunas veces los tubos de

agar urea de Christensen sin inocular, pueden virar a rojo púrpura (prueba positiva), debe incluirse, un tubo de

este agar sin inocular como control en una prueba negativa. Para Salmonella spp no se produce cambio en la

coloración (amarillo anaranjado). Incubar 24h ± 2h a 36°C ± 1°C.

b) Caldo L-lisina descarboxilasa.

Si la prueba de LIA fue satisfactoria, no es necesario repetirla. Si la reacción de LIA fue dudosa, utilizar

caldo lisina descarboxilasa para la determinación final de lisina descarboxilasa. Inocular el caldo con pequeña

cantidad de cultivo. Cerrar la tapa fue rtemente e incubar a 36°C ± 1°C por 24h ± 3h. Las especies de

Salmonella spp dan reacción alcalina por descarboxilación de la lisina (color púrpura del medio). La prueba

negativa se interpreta por un color amarillo del medio. Si el medio aparece descolorid o (ni púrpura, ni

amarillo), agregar unas gotas de colorante púrpura de bromocresol al 0.2% y leer nuevamente la reacción.

c) Detección de -galactosidasa.

Colocar la colonia seleccionada en un tubo conteniendo 0.25mL de soluc ión salina, agitar para obtener

una suspensión homogénea. Adicionar una gota de tolueno y agitar. Colocar el tubo en un baño de agua a

36°C ± 1°C dejar reposar por aproximadamente 5 min. Adicionar 0.25mL del agente de detección de la -

galactosidasa y mezclar. Colocar nuevamente el tubo en el baño de agua a 36°C ± 1°C y dejar por 24h ± 3h.

Examinar el tubo a intervalos de tiempo. Un color amarillo es indicativo de reacción positiva, la cual se hace

evidente en aproximadamente 20 min. Si se utilizan discos c omerciales, seguir las instrucciones del

fabricante.

d) Prueba de Indol.

Inocular un tubo conteniendo 5mL del caldo triptona con una suspensión homogénea de la colonia

sospechosa.

Incubar a 36°C ± 1°C por 24h ± 3h después de la incubación adicionar de 0.2m L a 0.3 mL de reactivo de

Kovac, sin agitar y resbalando por las paredes.

La formación de un anillo de color rojo indica una reacción positiva. Un anillo de color amarillo indica una

reacción negativa.

e) Prueba de VP.

Re-suspender una asada de la colonia seleccionada en un tubo estéril conteniendo 3mL del medio VP.

Incubar 36°C ± 1°C por 24h ± 3h.

Después de la incubación adicionar dos gotas de solución de creatina, tres gotas de solución á -naftol y al

final dos gotas de solución de KOH, agitar después de cada reactivo.

f) Identificación presuntiva del género Salmonella spp.

Alternativamente se pueden utilizar pruebas bioquímicas miniaturizadas o métodos de biología molecular

disponibles en el mercado para la identificación presuntiva de género Salmonella spp, se deberá utilizar un

sistema adecuado basado en el sistema bioquímico descrito en esta sección. Estos sistemas bioquímicos

deberán contar con validación y no deben ser usados como sustitutos de las pruebas serológicas. Inocular e

incubar estos sistemas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

A.7.3.5.1 Interpretación de las pruebas bioquímicas.

Tabla A.1 Interpretación de pruebas bioquímicas.

Pruebas a

Cepas de Salmonella

S. typhi S. Paratyphi A S. Paratyphi B S. Paratyphi C Otras cepas

Reacción %b Reacción %b Reacción %c Reacción %c Reacción %b

TSI producción de ácido de la

glucosa

+ 100 + 100 + + + 100

TSI formación de gas de la

glucosa

- d 0 + 100 + + + 92

TSI producción de ácido de la

lactosa

- 2 - 100 - - - 1

TSI producción de ácido de

sucrosa

- 0 - 0 - - - 1

TSI producción de sulfuro de

hidrogeno

+ 97 - 10 + + + 92

Hidrólisis de urea - 0 - 0 - - - 1

Descarboxilación de la lisina - 98 - 0 + + + 95

Reacción de -galactosidasa - 0 - 0 - - - 2e

Reacción Voges-Proskauer - 0 - 0 - - - 0

Producción de indol - 0 - 0 - - - 1

a Ewing, W.h. y Ball, M. M. The biochemical reactions of the genus Salmonella. National Center for Disease Control

and Prevention, Atlanta, Georgia, USA, 1996.

b este porcentaje indica que no t odas las cepas de Salmonella muestran la reacción indicada puede ser más o

menos. Estos porcentajes pueden variar dependiendo de los serotipos de intoxicación alimentaria y su lugar de

procedencia.

c los porcentajes no han sido encontrados en la literatura.

d Salmonella Typhi es anaerobio.

e La Salmonella entérica subespecie Arizonae puede ser positiva o negativa a la lactosa pero siempre será -

galactosidasa positiva.

S. diarizonae (ATCC 12325) lactosa positivos, H 2S positivo y S. abortus equi (ATCC 9842) , lactosa -

negativo, H2S-negativo; o S. diarizonae (ATCC 29934) lactosa-positivo, H2S-negativo.

A.7.3.5.2 Pruebas Serológicas.

A.7.3.5.3 General.

La aglutinación con el antisuero polivalente Poly A-I & Vi, puede usarse como resultado confirmatorio de la

presencia de Salmonella spp para las cepas probadas por TSI y LIA, existen cepas que no aglutinan con el

polivalente, pero que dan reacciones típicas en TSI y LIA, para éstas es necesario confirmar usando la batería

completa de bioquímicas.

A.7.3.5.4 Eliminación de las cepas autoaglutinables.

Deposite una gota de solución salina, en un portaobjetos perfectamente limpio. Disperse con un asa, parte

de la colonia a probar en la gota, de manera que se obtenga una suspensión homogénea y turbia. Rote

suavemente la l ámina por 30s a 60s. Observe el resultado sobre un fondo oscuro, preferiblemente con la

ayuda de una lupa. Si las bacterias se agrupan en grumos de diferentes tamaños, la cepa se considera como

autoaglutinable deberán identificarse por pruebas bioquímicas complementarias y no someterse a la

serotipificación.

NOTA: También es posible dispersar parte de la colonia a analizar en una gota de agua y luego mezclar

esta solución con una gota de la solución salina.

A.7.3.5.5 Detección de los antígenos Poly A-I & Vi.

Empleando una colonia pura no autoaglutinable, proceda, empleando una gota de la solución salina en

una lámina de vidrio, disperse con el asa hasta obtener una suspensión homogénea y agregue una gota del

antisuero O. Si se produce aglutinación, la reacci ón se considera positiva del antisuero O en lugar de la

solución salina. Si se produce aglutinación, la reacción se considera positiva.

Para fines de vigilancia sanitaria, enviar el cultivo al laboratorio de referencia CCAyAC de la COFEPRIS

para su identificación serológica o molecular.

A.8 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.

a) Los cultivos determinados como presuntivos con las pruebas bioquímicas y confirmados por la

serología, informar como:

Salmonella spp en 25g: PRESENCIA.

b) Descartar los cultivos c on resultados atípicos a partir de las pruebas bioquímicas miniaturizadas

clasificadas como no Salmonella spp, informar:

Salmonella spp en 25g: AUSENCIA.

c) Placas con agar XLD, ASB y el tercer medio selectivo sin desarrollo y/o colonias atípicas, informar:

Salmonella spp en 25g: AUSENCIA.

d) En caso de que la cantidad sea menor a 25g se debe reportar la presencia o ausencia de Salmonella

spp en la porción de ensayo (g o mL) de producto utilizado.

e) Para los casos en los que se analiza una pieza de produc to reportar como presencia o ausencia por

piezas analizadas.

A.9 AYUDA VISUAL.

A.10 FORMULACIONES Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.

Alternativamente pueden utilizarse medios comerciales con excepción del medio RVS ya que en punto

A.10.2.1.2 se indica que debe prepararse por ingredientes

La caducidad de los medios de cultivo una vez preparado deberá ser demostrada en el laboratorio bajo las

condiciones de almacenamiento particulares con excepción del medio RVS y que en el punto A.10.2.4.2

indica que debe s er usado el día de su preparación, el Caldo MKTTn para el que se indica en el punto

A.10.3.4.2 que el medio de ben usarse el mismo día de su preparación, el medio XLS para el que se

indica que no debe usarse por más de 5 días.

A.10.1 Agua peptonada amortiguada.

A.10.1.1 Fórmula.

Digerido enzimático de caseína

NaCl

Na2HPO4.12H2O

KH2PO4

Agua

10.0g

5.0g

9.0g

1.5g

1 000mL

A.10.1.2 Preparación: Disolver los ingredientes en el agua, calentar si es necesario. Ajustar el pH, de tal

manera que después de la esteril ización sea 7.0 ± 0.2 a 25°C. Distribuir el medio en frascos de capacidad

necesaria para obtener las porciones de prueba. Esterilizar en autoclave 15 min a 121°C.

A.10.2 Caldo RVS.

A.10.2.1 Solución A.

A.10.2.1.1 Fórmula.

Digerido enzimático de soya

NaCl

KH2PO4

K2HPO4

Agua

5.0g

8.0g

1.4g

0.2g

1000mL

A.10.2.1.2 Preparación: Preparar por ingredientes y disolverlos en el agua, es necesario calentar

aproximadamente a 70°C. La solución debe prepararse el día de la preparación del medio de RVS completo.

A.10.2.2 Solución B.

A.10.2.2.1 Fórmula.

MgCl2.6H2O

Agua

400.0g

1000mL

A.10.2.2.2 Preparación: Disolver el cloruro de magnesio en el agua. Como esta sal es muy higroscópica,

es aconsejable disolver el contenido completo de un frasco nuevo de MgCl 2.6H2O de acuer do a la fórmula.

Por ejemplo, agregando 250g de MgCl 2.6H2O a 625mL de agua, dará un volumen total de solución de 788mL

y una concentración de 31.7g por cada 100mL de MgCl2.6H2 aproximadamente.

La solución puede almacenarse en un frasco ámbar con tapa hermé tica a temperatura ambiente por 2

años.

A.10.2.3 Solución C.

A.10.2.3.1 Fórmula.

Oxalato de verde malaquita

Agua

0.4g

100mL

A.10.2.3.2 Preparación: Disolver el oxalato de verde malaquita en el agua. La solución puede

almacenarse en frasco ámbar a temperatura ambiente por 8 meses.

A.10.2.4 Medio Completo.

A.10.2.4.1 Fórmula.

Solución A

Solución B

Solución C

1000mL

100mL

10mL

A.10.2.4.2 Preparación: Agregar 1000mL de la solución A, 100mL de la solución B y 10mL de la solución

C. Ajustar el pH, si es necesario, de tal manera que después de la esterilización sea de 5.2 ± 0.2. Antes de su

uso, distribuir porciones de 10mL a cada tubo. Esterilizar a 115°C por 15 min. Almacenar el medio preparado

a 3°C ± 2°C, utilizar el medio el mismo día de su preparación.

Nota: La composición final del medio completo será de: Digerido enzimático de soya, 4.5g/L; NaCl, 7.2g/L;

KH2PO4 + K2HPO4, 1.44g/L; MgCl2, 13.4g/L o MgCl2.6H2O, 28.6g/L; oxalato de verde malaquita, 0.036g/L.

A.10.3 Caldo MKTTn.

A.10.3.1 Medio Base.

A.10.3.1.1 Fórmula.

Extracto de carne

Digerido enzimático de caseína

NaCl

CaCO3

Na2S2O3.5H2O

Ox sales biliares uso bacteriológico

Verde brillante

Agua

4.3g

8.6g

2.6g

38.7g

47.8g

4.78g

0.0096g

1000mL

A.10.3.1.2 Preparación: Disolver los ingredientes deshidratados básicos de la fórmula o el medio

completo deshidratado en el agua, hervir por 5 min. Ajustar el pH, si es necesario, a 8.2 ± 0.2 a 25°C. El

medio base puede almacenarse por 4 semanas a 3°C ± 2°C.

A.10.3.2 Solución de Yodo–Yoduro

A.10.3.2.1 Fórmula.

Yodo

Yoduro de potasio (KI)

Agua

20.0g

25.0g

100mL

A.10.3.2.2 Preparación: Disolver completamente el yoduro de potasio en 10mL de agua, agregar el yodo

y diluir a 100mL con agua estéril. No calentar.

Almacenar la solución en la oscuridad a temperatura ambiente en un frasco bien cerrado.

A.10.3.3 Solución de Novobiocina.

A.10.3.3.1 Fórmula.

Novobiocina (sal sódica)

Agua

0.04g

5.0mL

A.10.3.3.2 Preparación: Disolver la novobiocina (sal sódica) en el agua y esterilizar por filtración. Puede

almacenar la solución por no más de 4 semanas a 3°C ± 2°C.

A.10.3.4 Medio Completo.

A.10.3.4.1. Fórmula.

Medio base

Solución de yodo-yoduro

Solución de novobiocina

1000mL

20mL

5mL

A.10.3.4.2. Preparación: Agregar asépticamente 5mL de solución de novobiocina a 1000mL de medio

base. Mezclar, después agregar 20mL de la solución de yodo -yoduro. Mezclar bien. Distribuir el medio

asépticamente en recipientes estériles de suficiente capacidad para contener las porciones necesarias de

prueba. El medio completo deberá utilizarse el mismo día de la preparación.

A.10.4 Agar XLD.

A.10.4.1 Medio Base.

A.10.4.1.1 Fórmula.

Extracto de levadura en polvo

NaCl

Xilosa

Lactosa

Sacarosa

L-Lisina

Tiosulfato de sodio

Citrato férrico amónico

Rojo de fenol

Desoxicolato de sodio

Agar

Agua

3.0g

5.0g

3.5g a 3.75g

7.5g

7.5g

5.0g

6.8g

0.8g

0.08g

1.0g a 2.5g

9.0g a 18.0g

1000mL

A.10.4.1.2 Preparación: Disolver los ingredientes básicos deshidratados de la fórmula o el medio

completo deshidratado en el agua por calentamiento, con agitación frecuente, hasta que el medio comience a

hervir. Evitar el sobrecalentamiento. Ajustar el pH, si es necesario, a 7.4 ± 0.2 a 25°C.

A.10.4.1.3 Preparación de las placas de agar: Transferir el medio inmediatamente a un baño de agua a

44°C – 47°C y esperar a que el medio se atem pere, agitar y vaciar en las placas, dejar solidificar. Antes de su

uso las placas deberán estar completamente secas, se recomienda secar las placas en horno entre 37°C y

55°C con las tapas parcialmente abiertas o en campana de flujo laminar hasta que la s uperficie del agar este

seca. El medio se puede almacenar por no más de 5 días a 3°C ± 2°C.

A.10.5 Agar nutritivo.

A.10.5.1 Fórmula.

Extracto de carne

Peptona

Agar

Agua

3.0g

5.0g

15.0g

1000mL

A.10.5.2 Preparación: Disolver los ingredientes o el medio com pleto deshidratado en el agua, por

calentamiento. Si es necesario, ajustar el pH de tal manera que después de la esterilización quede en 6.8 ±

0.2 a 25°C. Transferir el medio de cultivo a tubos o botellas de capacidad apropiada. Esterilizar por 15 min a

121°C.

A.10.5.2.1 Preparación de las placas de agar nutritivo: Transferir el medio inmediatamente a un baño

de agua a 44°C – 47°C y esperar a que el medio se atempere, agitar y vaciar 15mL del medio fundido a

placas estériles, dejar solidificar. Las superfic ies de las placas deben estar completamente secas antes de su

uso, se recomienda secar las placas en un horno entre 37°C y 55°C con las tapas parcialmente abiertas o en

campana de flujo laminar hasta que la superficie del agar este seca.

A.10.6 Agar TSI.

A.10.6.1 Fórmula.

Extracto de carne

Extracto de levadura

Peptona

NaCl

Lactosa

Sacarosa

Glucosa

Citrato de fierro (III)

Tiosulfato de sodio

Rojo de fenol

Agar

Agua

3.0g

3.0g

15.0g a 20.0g

5.0g

10.0g

10.0g

1.0g

0.2g a 0.3g

0.3g

0.024g

12.0g a 15.0g

1000mL

A.10.6.2 Preparación: Disolver los ingredientes o el medio completo deshidratado en el agua por

calentamiento. Si es necesario, ajustar el pH de tal manera que después de la esterilización quede en 7.4 ±

0.2 a 25°C. Distribuir 10mL del medio en tubos de ens aye. Esterilizar por 15 min a 121°C. Dejar solidificar en

posición inclinada para obtener un fondo de 4cm y un bisel de al menos 2.5cm.

A.10.7 Agar Urea de Christensen.

A.10.7.1 Medio Base.

A.10.7.1.1 Fórmula.

Peptona

Glucosa

NaCl

Fosfato dihidrogenado de potasio (KH2PO4)

Rojo de fenol

Agar

Agua

1.0g

1.0g

5.0g

2.0g

0.012g

15.0g

1000mL

A.10.7.1.2 Preparación: Disolver los ingredientes o el medio completo deshidratado por calentamiento. Si

es necesario, ajustar el pH de tal manera que después de la esterili zación quede en 6.8 ± 0.2 a 25°C.

Esterilizar por 15 min a 121°C.

A.10.7.2 Solución de urea.

A.10.7.2.1 Fórmula.

Urea

Agua, para un volumen final de

400g

1000mL

A.10.7.2.2 Preparación: Disolver la urea en el agua. Esterilizar por filtración.

A.10.7.3 Medio Completo.

A.10.7.3.1 Fórmula.

Medio base

Solución de Urea

950mL

50mL

A.10.7.3.2 Preparación: Agregar bajo condiciones asépticas, la solución de urea al medio base,

previamente fundido y mantenido de 44°C – 47°C en el baño de agua. Distribuir 10mL del medio completo a

tubos de ensaye.

A.10.8 Reactivo de ß-Galactosidasa.

A.10.8.1 Solución amortiguadora.

A.10.8.1.1 Fórmula.

NaH2PO4

NaOH, 10mol/L solución

Agua, para un volumen final de

6.9g

~ 3mL

50mL

A.10.8.1.2 Preparación: Disolver el fosfato dihidro genado de sodio en ~ 45mL de agua en un matraz

volumétrico. Ajustar el pH a 7.0 ± 0.2 a 25°C con la solución de hidróxido de sodio. Agregar agua para un

volumen final de 50mL.

A.10.8.2 Solución de ONPG.

A.10.8.2.1 Fórmula.

ONPG

Agua

0.08g

15mL

A.10.8.2.2 Preparación: Disolver el ONPG en el agua a aproximadamente 50°C. Enfriar la solución.

A.10.8.3 Reactivo Completo.

A.10.8.3.1 Fórmula.

Solución amortiguadora

Solución de ONPG

5mL

15mL

A.10.8.3.2 Preparación: Agregar la solución amortiguadora a la solución de ONPG.

A.10.9 Reactivos para la prueba VP.

A.10.9.1 Medio de RM-VP.

A.10.9.1.1. Fórmula.

Peptona

Glucosa

K2HPO4

Agua

7.0g

5.0g

5.0g

1000mL

A.10.9.1.2 Preparación: Disolver los ingredientes en agua, calentar si es necesario. Ajustar el pH de tal

forma que después de la esterilización quede a 6.9 ± 0.2 a 25°C. Transferir 3mL de volumen a tubos de

ensaye y esterilizar por 15 min a 121°C.

A.10.9.2 Solución de creatina (N-amidinosarcosina).

A.10.9.2.1 Fórmula.

Monohidrato de creatina

Agua

0.5g

100mL

A.10.9.2.2 Preparación: Disolver el monohidrato de creatina en el agua.

A.10.9.3 -naftol, solución etanólica

A.10.9.3.1 Fórmula

-Naftol

Etanol al 96%

6g

100mL

A.10.9.3.2 Preparación: Disolver el 1-naftol en el etanol.

A.10.9.4 Solución de KOH.

A.10.9.4.1 Fórmula.

KOH

Agua

40g

100mL

A.10.9.4.2 Preparación: Disolver el KOH en el agua.

A.10.10 Reactivos para la reacción de Indol.

A.10.10.1 Caldo triptona al 1%.

A.10.10.1.1 Fórmula.

Triptona o tripticasa 10g

Agua destilada 1000mL

pH final: 6,9 ± 0,2

A.10.10.1.2 Preparación: Disolver los ingredientes, distribuir en porciones de 5mL en tubos de ensaye de

16mm x 125mm o 16mm x 150mm y esterilizar a 121°C por 15 min.

A.10.11 Reactivo de Kovac.

A.10.11.1 Fórmula.

4-Dimetilaminobenzaldehido

Ácido hidroclórico,  = 1.18 g/mL a 1.19 g/mL

2-metilbutan-2-ol

5g

25mL

75mL

A.10.11.2 Preparación: Mezclar los componentes.

A.10.12 Solución Salina Fisiológica.

A.10.12.1 Fórmula.

NaCl

Agua

8.5g

1000mL

A.10.12.2 Preparación: Disolver el cl oruro de sodio en el agua. Si es necesario, ajustar el pH de tal

manera que después de la esterilización quede en 7.0 ± 0.2 a 25°C. Distribuir volúmenes de la solución de tal

manera que después de la esterilización queden entre 90mL a 100mL. Esterilizar 15 min a 121°C.

A.10.13 Agar EH.

A.10.13.1 Fórmula.

Peptona 12g a 15g

Extracto de levadura 3g

Sales biliares No. 3 9g

Lactosa 12g

Sacarosa 12g

Salicina 2g

NaCl 5g

Tiosulfato de sodio 5g

Citrato férrico amónico 1.5g

Azul de bromotimol 0.064g a 0.065g

Fucsina ácida 0.1g

Agar 14.0g

Agua destilada 1L

pH final 7.5 ± 0.2

A.10.13.2 Preparación: Calentar a ebullición con agitación frecuente para disolver los ingredientes por no

más de 1 min. No sobrecalentar. Enfriar a 45°C-50°C. Distribuir en porciones de 20mL en cajas Petri de 15mm

x 100mm. Dejar secar por 2h con las tapas parcialmente abiertas. Almacenar hasta 30 días en refrigeración

(4°C ± 2°C).

A.10.14 Agar ASB.

A.10.14.1 Fórmula.

Polipeptona (o peptona) 10g

Extracto de carne 5g

Dextrosa 5g

Na2HPO4 (anhidro) 4g

FeSO4 (anhidro) 0.3g

Sulfito de bismuto (indicador) 8g

Verde brillante 0.025g

Agar 15g a 20g

Agua destilada

pH, 7.7 ± 0.2

1L

A.10.14.2 Preparación: Mezclar los ingredientes con calentamiento y agitación constante a ebullición po r

1 min hasta obtener una suspensión uniforme (el precipitado no se disuelve). Enfriar a 45°C -50ºC. Suspender

el precipitado con agitación suave y distribuir volúmenes de 20mL en cajas Petri estériles de 15mm x 100mm.

Permitir que seque el agar por 2h con las tapas parcialmente abiertas y después cerrarlas.

PRECAUCIÓN: No esterilizar. Preparar el medio un día antes de su uso y almacenar en oscuridad. El

medio pierde selectividad después de 48h.

A.10.15 Caldo L-lisina descarboxilasa.

A.10.15.1 Fórmula.

Monoclorhidrato de L-lisina 5.0g

Extracto de levadura 3.0g

Glucosa 1.0g

Púrpura de bromocresol 0.015g a 0.02g

Peptona 5.0g

Agua 1000 mL

A.10.15.2 Preparación: Disolver los componentes en el agua, con el calentamiento necesario. Ajustar el

pH si es necesario y después de la esterilización debe ser 6.8 ± 0.2 a 25°C. Transferir el medio en cantidades

de 2mL a 5mL y esterilizar en autoclave por 15 min a 121°C.

A.10.16 Agar de hierro y lisina (LIA).

A.10.16.1 Fórmula.

Peptona de gelatina 5.0g

Extracto de levadura 3.0g

Glucosa 1.0g

L-lisina 10.0g

Citrato férrico-amónico 0.5g

Tiosulfato de sodio anhidro 0.04 g

Púrpura de bromocresol 0.02 g

Agar 13.0g a 15.0g

Agua destilada

pH, 6.7 ± 0.2

100mL

A.10.16.2 Preparación: Suspender los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien, calentar hasta

ebullición con agitación frecuente hasta conseguir la disolución completa. Ajustar el pH.

Distribuir en volúmenes de 3mL en tubos de 13mm x 100mm, con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave

a 121°C durant e 12 min. Dejar que los tubos se enfríen en posición inclinada, de tal modo que se obtengan

columnas de medio de 4cm y una superficie inclinada de 2cm. En el punto A.7.3.5 donde se hace mención

que el bisel deberá tener una longitud de al menos 2.5cm. El medio ya preparado es de color púrpura.