Apéndice B — NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos.

Apéndice B Normativo.

Método de referencia para la estimación de la cuenta de S. aureus.

Se establece el método microbiológico para determinar la cuenta de S. aureus presente en alimentos para

consumo humano nacionales o de importación.

B.1 INTRODUCCIÓN.

S. aureus es una bacteria altamente vulnerable a tratamientos térmicos y a varios agentes sanitizantes. La

presencia de esta bacteria en los alimentos procesados o en los equipos donde se procesan, es generalmente

un indicador de sanitización inadecuada o manejo inadecuado durante la producción. S. aureus produce

enterotoxinas termorresistentes que al ingerirse pueden causar intoxicaciones alimentarias. Es actualmente

responsable de un alto porcentaje de los brotes de intoxicación alimentaria a nivel mundial.

Para el propósito del presente método, la confirmación de S. aureus está basada en una fuerte reacción

de coagulasa, pero se reconoce que hay algunas cepas de S. aureus que producen una reacción débil. Estas

últimas cepas se pueden confundir con otras bacterias, por lo cual es de igual importancia someter a la par la

prueba de termonucleasa y por medio del uso de pruebas adicionales, como son la producción de ácido a

partir del manitol, entre otras.

Este método perm ite hacer una estimación del contenido de S. aureus en los productos de consumo, se

efectúa directamente en placas de medio de cultivo selectivo y diferencial, con la confirmación mediante las

pruebas de coagulasa/termonucleasa como determinante y pruebas auxiliares.

B.2 EQUIPO.

B.2.1 Horno para esterilizar que alcance 180°C;

B.2.2 Autoclave;

B.2.3 Balanza granataria;

B.2.4 Incubadora capaz de operar a 36°C ± 1ºC;

B.2.5 Homogeneizador peristáltico tipo Stomacher o licuadora, y

B.2.6 Baño de agua capaz de operar a 35°C ± 1ºC.

B.3 MATERIALES.

B.3.1 Cuchillos, pinzas, tijeras, cucharas, espátulas;

B.3.2 Tubos de cultivo de 16mm x 150mm o frascos de 125mL a 250mL de capacidad;

B.3.3 Tubos de cultivo de 10mm x 75mm;

B.3.4 Cajas Petri de 90mm a 100mm de diámetro;

B.3.5 Pipetas de 1mL y 10mL de capacidad graduada en 0.1mL y 1mL respectivamente y diámetro de

2mm a 3mm;

B.3.6 Pipetas Pasteur;

B.3.7 Probetas;

B.3.8 Varillas de vidrio de 3.5mm de diámetro aproximadamente y 20cm de largo dobladas en ángulo recto

u equivalente;

B.3.9 Matraz Erlenmeyer, y

B.3.10 Cámara húmeda: consiste en una caja Petri en la cual se coloca una varilla de vidrio en forma de

"V" rodeada de algodón humedecido con agua.

B.4 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS.

B.4.1 Agar Baird Parker;

B.4.2 Solución de telurito de potasio;

B.4.3 Emulsión de yema de huevo (puede usarse comercialmente preparada);

B.4.4 BHI;

B.4.5 Solución reguladora de fosfatos;

B.4.6 Agua peptonada;

B.4.7 Solución Salina 0.85%;

B.4.8 Agar Azul de Toluidina-ADN;

B.4.9 Plasma de Conejo con EDTA;

B.4.10 Agua peptonada amortiguada;

B.4.11 Peróxido de hidrógeno al 3%;

B.4.12 Reactivos para la tinción de Gram;

B.4.13 Caldo rojo de fenol (glucosa y manitol);

B.4.14 Aceite de parafina o mineral estéril;

B.4.15 S. aureus ATCC 6538, 25923;

B.4.16 S. epidermidis ATCC 12228, y

B.4.17 Solución trazable para verificación de potenciómetro.

B.5. CONDICIONES DE PRUEBA.

B.5.1 Preparación de la muestra.

Tomar diferentes porciones del alimento, transferir 25g o mL a frascos de dilución con 225mL de solució n

reguladora de fosfatos, fosfatos o agua peptonada amortiguada, para preparar una dilución 1:10.

Cuando no se disponga de 25g de muestra se deberá justificar y utilizar la cantidad necesaria de solución

reguladora de fosfatos, para obtener una dilución 1:10.

Homogeneizar por 1 min o 2 min en licuadora u homogeneizador peristáltico.

B.5.2 Preparación de la muestra para Moluscos en concha.

Preparar como se indica en el punto A.6.2.4.

B.5.3 Procedimiento para Moluscos, desconchados y congelados.

Preparar como se indica en el punto A.6.2.5.

B.5.4 Productos de la pesca.

Pesar 200g del alimento en 200mL de regulador de fosfatos o agua peptonada amortiguada (dilución 1:2)

y homogeneizar por 2 min en vaso de licuadora u homogeneizador peristáltico, el volumen total en el vaso

debe cubrir totalmente las aspas. Las muestras congeladas deben descongelarse en refrigeración (2ºC -5ºC)

un máximo de 18h antes de su análisis.

B.6 PROCEDIMIENTO ANALÍTICO.

B.6.1 Transferir por medio de una pipeta estéril, 0.1mL de la muestra d irecta si es líquida, o 0.1mL de la

suspensión inicial (dilución 10 -1) en el caso de otros productos, por duplicado a cajas de agar Baird Parker.

Repetir el procedimiento para las diluciones siguientes si son necesarias 10-2, 10-3.

Nota: Si se sospecha que el alimento contiene bajas cuentas de S. aureus, se deberá aumentar el límite

de detección, en un factor igual a 10 inoculando 1mL de la muestra directa si ésta es líquida, o de cada

dilución distribuida en 3 placas como sigue: 0.4mL, 0.3mL y 0.3mL sobre la superficie de las placas de agar

Baird-Parker, por duplicado. En ambos casos evitar usar cajas húmedas.

B.6.2 Cuidadosamente distribuir el inóculo tan pronto como sea posible, sobre la superficie del agar con

varillas estériles de vidrio en ángulo recto, utilizando una para cada placa y dilución.

B.6.3 Mantener las placas con las tapas hacia arriba hasta que el inóculo sea absorbido totalmente por el

agar.

B.6.4. Invertir las placas e incubar por 44h a 48h a 36ºC ± 1ºC, buscar colonias con morfología col onial

típica: colonias negras, circulares, brillantes, convexas, lisas, de diámetro de 1mm a 2mm y muestran una

zona opaca, húmedas y con un halo claro (debido a la actividad de la lecitinasa) alrededor de la colonia.

NOTA: En algunas ocasiones cepas que h an sido aisladas de productos congelados o deshidratados que

han sido almacenados por periodos largos de tiempo, frecuentemente desarrollan colonias menos negras con

apariencia rugosa y textura seca. Las colonias atípicas son similares en apariencia pero s in halo claro

alrededor.

B.6.5 Seleccionar las placas que tengan entre 15 y 150 colonias típicas y atípicas de S. aureus; si no es

posible, seleccionar las placas de las diluciones más altas no obstante tengan más de 150 colonias.

Seleccionar por muestra 5 colonias típicas para su confirmación o 5 colonias atípicas, para la realización de la

tinción de Gram, en el caso de observar bacilos positivos, la colonia se tomará como negativa para S. aureus,

por lo contrario si se observan cocos se seguirá con su confirmación.

B.6.6 Cuando las placas tengan menos de 15 colonias típicas se debe agregar la nota de "valor estimado"

al reporte de los resultados.

B.6.7 Si fue inoculado 1.0mL en 3 placas, tratar éstas como una sola y seguir los procedimientos de

confirmación.

B.6.8 Confirmación.

B.6.8.1 Prueba de coagulasa. Seleccionar y sembrar cada colonia típica en tubos con 0.5mL de BHI y en

tubos con AST. Utilizar simultáneamente un control positivo de S. aureus y un control negativo de S.

epidermidis. Incubar a 35°C ± 1ºC en baño de agua, durante 20h a 24h. Mantener los cultivos en AST a no

más de 27°C ± 1ºC para pruebas posteriores. Agregar a 0.1mL del cultivo anterior a 0.3mL de plasma de

conejo con EDTA (a menos que el fabricante indique otras cantidades). Incubar a 37°C ± 1ºC en baño de agua

y observar periódicamente a intervalos de 1h durante las primeras 4h a 6h; si no hay formación de coágulo,

observar hasta las 24h. Considerar la prueba positiva cuando el coágulo se forma completamente y es firme al

invertir el tubo. En otro caso se deberán realizar las pruebas auxiliares, descritas en el punto B.6.9.

B.6.8.2 Para cada lote nuevo de reactivo se deberá realizar la prueba de coagulabilidad del plasma de

conejo añadiendo una gota de cloruro de calcio al 5% a 0.5mL d e plasma reconstituido, formándose un

coágulo en 10s-15s.

B.6.8.3 Prueba de termonucleasa. Preparar portaobjetos con 3mL de agar azul de toluidina -ADN. Con

ayuda de una pipeta Pasteur hacer orificios equidistantes en el agar. En un baño de agua hirviendo c alentar

durante 15 min, 0.3mL de cultivo en BHI. Utilizando una pipeta Pasteur transferir una gota del cultivo a un

orificio del medio, repetir para cada cepa incluyendo testigos positivo y negativo. Incubar a 35ºC ± 1°C en

cámara húmeda de 4h a 24h. La aparición de un halo color rosa extendido de por lo menos 1mm alrededor de

la perforación califica como positiva la prueba.

B.6.9 Pruebas auxiliares.

B.6.9.1 Realizar una tinción de Gram a cada cultivo y observar al microscopio la presencia de cocos Gram

positivos, agrupados en racimos.

B.6.9.2. Si se dispone de un sistema de bioquímicas miniaturizado, éste puede ser utilizado como

alternativa de las siguientes pruebas bioquímicas, con excepción de la tinción de Gram, coagulasa y

termonucleasa:

B.6.9.2.1 Prueba de catalasa. A partir de un cultivo en AST realizar la prueba de la catalasa en un

portaobjetos, emulsificar una porción del cultivo con una gota de peróxido de hidrógeno al 3%. Observar la

producción de burbujas de gas.

B.6.9.2.2 Utilización anaeróbica del manitol. Inocular un tubo con caldo para la fermentación adicionado de

manitol al (0.5%), con un inóculo abundante. Cubrir el caldo con una capa de aceite de parafina o aceite

mineral de al menos 25mm. Incubar hasta 5 días a 36°C ± 1ºC. Un cambio en l a coloración del indicador

indica la utilización anaeróbica del manitol y la presencia S. aureus. Incluir los controles positivos y negativos.

B.6.9.2.2.3 Utilización anaeróbica de la glucosa. Inocular un tubo con caldo para la fermentación

adicionado de g lucosa al (0.5%), con un inóculo abundante. Cubrir el caldo con una capa de aceite de

parafina o aceite mineral de al menos 25mm. Incubar hasta 5 días a 36°C ± 1ºC. Un cambio en la coloración

del indicador indica la utilización anaeróbica de la glucosa y l a presencia S. aureus. Incluir los controles

positivos y negativos.

Tabla B.1. Características de S. aureus, S. epidermidis y Micrococcus.

Características S. aureus S. epidermidis Micrococcus

Actividad de catalasa + + +

Producción de coagulasa + - -

Producción de termonucleasa + - -

Utilización anaeróbica de: Glucosa + + -

Utilización anaeróbica de: Manitol + - -

+, La mayoría de las cepas son positivas (más del 90%).

- , La mayoría de las cepas son negativas (más del 90%).

B.7 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.

B.7.1 Las pruebas de termonucleasa o coagulasa positiva son consideradas como resultados

confirmatorios de S. aureus.

B.7.2 Si al menos el 80% de las colonias típicas seleccionadas fueron coagulasa positiva y/o

termonucleasa positiva tomar el número total de las colonias contadas como presuntivas de S. aureus.

B.7.3 En otros casos, calcular el número de colonias presuntivas de S. aureus a partir del porcentaje

obtenido de colonias coagulasa y/o termonucleasa positivas confirmadas.

B.7.4 Promediar los resultados de los duplicados.

B.7.5 Cuando en dos diluciones consecutivas se obtienen cuentas entre 15 y 150 colonias (típicas o

atípicas) calcular el número de S. aureus para cada dilución como se especifica en los puntos anteriores,

calcular la cuenta de S. aureus considerando el factor de dilución, calcular el logaritmo en base diez de cada

dilución y realizar la resta de éstos, si la diferencia entre los logaritmos de las dos diluciones es menor a 0.3,

reportar el promedio de las dos diluciones. Si por el contrario la diferencia entre los logaritmos es mayor a 0.3;

reportar el valor más bajo.

B.7.6 Cuando no se tenga crecimiento reportar como:

DILUCIÓN DE LA MUESTRA VOLUMEN INOCULADO RESULTADO

MUESTRA DIRECTA 1mL (0.4mL, 0.3mL Y 0.3 mL) < 1 UFC/mL

MUESTRA DIRECTA 0.1 mL < 10 UFC/mL

10-1 1mL (0.4, 0.3 Y 0.3 mL) < 10 UFC/mL

10-1 0.1mL < 100 UFC/mL

B.7.7 Ejemplo para el cálculo de S. aureus.

Por ejemplo, el 0.1mL del inóculo de la dilución 10 -2 de la muestra da como resultado 65 y 85 colonias

típicas por placa.

Ninguna colonia atípica fue identificada en las placas.

Todas las 5 colonias seleccionadas de la placa conteniendo 65 colonias fueron coagulasa y termonucleasa

positiva por lo que las 65 colonias fueron consideradas como S. aureus.

3 de las 5 colonias seleccionadas de la placa que contiene 85 colonias fueron coagulasa y termonucleasa

positiva por lo que el 60%, es decir, 51 colonias son consideradas como S. aureus.

La cuenta promedio tomando en cuenta solo las positivas es:

65+51/2 = 58 S. aureus. Redondeando a dos cifras significativas  60

58 por el inverso del factor de dilución (1/10-2) es 5800 UFC.

Si se considera que el in óculo fue de 0.1mL habrá que multiplicar por 10 para obtener 58000 UFC/mL o g

según la naturaleza de la muestra.

También puede aplicarse la siguiente formula:

B.7.8 Precisión de la cuenta.

Para razones estadísticas, los intervalos de confianza de este método varían en un 95% de los casos,

desde un ±16% a ±52%. En la práctica, una mayor variación se puede encontrar, espe cialmente entre los

resultados obtenidos por diferentes analistas.

B.8 Ayuda Visual.

B.9 Composición y preparación de medios de cultivo y reactivos.

B.9.1 Agar Baird Parker.

B.9.1.1 Medio base.

B.9.1.2 Fórmula.

Triptona 10.0g

Extracto de carne 5.0g

Extracto de levadura 1.0g

Piruvato de sodio 10.0g

Glicina 12.0g

Cloruro de litio .6H2O 5.0g

Agar 15.0 a 20.0g

Agua destilada

pH final 7.0 ± 0.2.

1L

B.9.1.3 Preparación: Disolver los ingredientes en 950mL de agua destilada con agitación constante y

calentamiento. Esterilizar 15 min a 121°C. Si se utiliza inmediatamente, mantenerlo fundido a 48°C-50ºC antes

de adicionar los ingredientes de enriquecimiento o almacenar el medio solidificado a 4 °C ± 1°C hasta 1 mes.

Fundir el medio antes de su uso.

Ingredientes de enriquecimiento: telurito y yema de huevo.

Adicionar asépticamente 5mL de yema de huevo -telurito de potasio a temperatura ambiente, a 95mL de la

base fundida. Mezclar bien evitando hacer burbujas y vaciar porciones de 15mL -18mL en cajas Petri 15m m x

100mm. El medio debe ser densamente opaco. Secar las placas antes de su uso. Guardar las placas

preparadas 20°C-25ºC hasta 5 días.

B.9.2 Emulsión de yema de huevo.

B.9.2.1 Preparación. (Sólo si una presentación comercial no está disponible).

Utilizar huevos frescos, separar la yema de la clara.

Mezclar las yemas con cuatro veces el volumen de agua, calentar la mezcla en un baño de agua,

controlando la temperatura a 45 °C ± 0.5°C por 2h y dejar reposar de 18h a 24h de 0 °C a + 5°C, dejar

precipitar.

Decantar el sobrenadante líquido y esterilizarlo por filtración, a menos que se haya llevado la separación

asépticamente. La emulsión puede ser almacenada de 2°C a 8°C por no más de 72h.

B.9.3 Solución de Telurito de potasio.

B.9.3.1 Fórmula.

Telurito de potasio (trioxotelurito dipotásico)

Agua

1.0g

100mL

B.9.3.2 Preparación: Disolver el telurito de potasio en agua con un mínimo calentamiento.

Esterilizar por filtración.

La solución puede ser conservada de 2°C a 8°C por 6 meses.

B.9.4 BHI.

B.9.4.1 Fórmula.

Peptona

Infusión cerebro de ternero deshidratado

Infusión corazón de res deshidratado

10.0g

12.5g

5.0g

Glucosa

Cloruro de sodio

Fosfato disódico Na2HPO4

Agua

2.0g

5.0g

2.5g

1000mL

B.9.4.2 Preparación: Disolver los componentes o el medio completo comercial e n agua hirviendo, ajustar

el pH para que después de la esterilización se encuentre en 7.4 ± 0.2 a 25°C.

Transferir el contenido a tubos o botellas en cantidades iguales a 10mL. Esterilizar el medio por 20 min a

121°C.

El medio puede ser almacenado por 6 meses en condiciones de refrigeración de 0°C a 5°C.

B.9.5 Plasma de Conejo.

B.9.5.1 Preparación: Utilizar el plasma de conejo que esté disponible comercialmente y rehidratar de

acuerdo a las instrucciones del fabricante. Adicionar el EDTA, en el plasma hidratado.

Si no encuentra plasma de conejo deshidratado comercial diluir plasma de conejo fresco en una

proporción 1:3 con agua estéril.

Antes de su uso probar cada lote de plasma de conejo con cepas positivas de S. aureus y con cepas

negativas.

B.9.6 Agar Azul de Toluidina.

B.9.6.1 Fórmula.

ADN de timo de carnero 0.3g

Agar 10g

CaCl2 (anhidro) 1.1mg

NaCl 10g

Azul de toluidina O 0.083g

Tris (hidroximetil aminometano) 6.1g

Agua destilada

pH 9.0 final

1L

B.9.6.2 Preparación: Disolver el Tris (hidroximetil aminometano) en 1L de agua destilada. Ajustar el pH a

9.0 adicionar los ingredientes restantes a excepción del azul de toluidina. Calentar a ebullición para disolver el

azul de toluidina en el medio. Distribuir en matraces o tubos de ensaye con tapa de ro sca. No es necesario

esterilizar si se usa inmediatamente. El medio estéril es estable a temperatura ambiente por 4 meses y es

satisfactorio después de varios ciclos de fusión.

Este medio se prepara por ingredientes.

B.9.7 Solución Reguladora de Fosfatos.

B.9.7.1 Fórmula.

Fosfato monopotásico 34.0g

Agua destilada

pH final 7.2 ± 0.2

1L

B.9.7.2 Preparación: Disolver el fosfato en 500mL de agua destilada y ajustar el pH a 7.2 con solución de

hidróxido de sodio 1N. Llevar a 1L con agua destilada. Esterilizar durante 15 min a 121°C ± 1°C.

Para diluciones:

Añadir 1.25mL de solución concentrada de reguladora de fosfatos a 1L de agua destilada y ajustar el pH a

7.2 distribuir en frascos de dilución. Esterilizar a 121°C ± 1°C durante 15 min.

B.9.8 AST.

B.9.8.1 Fórmula.

Tripticasa peptona 15g

Fitona peptona 5g

NaCl 5g

Agar 15g

Agua destilada

pH 7.3 ± 0.2

1L

B.9.8.2 Preparación: Suspender los ingredientes en 1L de agua destilada. Dejar reposar de 5 a 10 min.

Calentar con agitación constante para disolver el aga r. Hervir por 1 min. Distribuir en tubos, cajas o matraces.

Esterilizar a 121ºC por 15 min.

Cepas control: E. coli y S. aureus.

B.9.9 Caldo Rojo de Fenol (para fermentación de carbohidratos).

B.9.9.1 Fórmula.

Tripticasa o proteona peptona No. 3 10g

NaCl 5g

Extracto de carne (opcional). 1g

Rojo de fenol (7.2mL de solución de rojo de fenol al 0.25%) 0.018g

Agua destilada

pH 7.4 ± 0.2.

1L

Carbohidrato*

B.9.9.2 Preparación: Disolver los ingredientes sin el carbohidrato, en 800mL de agua destilada con

calentamiento y agitación ocasional. Distribuir en volúmenes de 2mL en tubos de 13mm x 100mm con

campana de Durham. Esterilizar a 121ºC por 15 min y dejar enfriar. Disolver 20g del carbohidrato en 200mL

de agua destilada y esterilizar por filtro de membrana, adicionar asépticamente 0.5mL del filtrado a cada tubo

con medio esterilizado y enfriado a menos de 45ºC, agitar suavemente para mezclar.

B.9.10 Aceite de parafina estéril.

Puede esterilizar por filtración en membrana de 0.22µm.

B.9.11 Agua peptonada amortiguada.

B.9.11.1 Fórmula.

Digerido enzimático de caseína 10.0g

NaCl 5.0g

Na2HPO4.12H2O 9.0g

KH2PO4 1.5g

Agua 1 000mL

B.9.11.2 Preparación: Disolver los ingredientes en el agua, calentar si es necesario. Ajustar el pH, de tal

manera que después de la esterilización sea 7.0 ± 0.2 a 25°C. Distribuir el medio en frascos de capacidad

necesaria para obtener las porciones de prueba. Esterilizar en autoclave 15 min a 121°C.