Apéndice C — NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos.

Apéndice C Normativo.

Método de referencia para el aislamiento de L. monocytogenes.

ADVERTENCIA.- Con la finalidad de proteger la salud del personal de laboratorio, se debe considerar que:

 Las pruebas para la determinación de L. monocytogenes deberán ser realizadas en laboratorios

debidamente equipados y por microbiólogos expertos, cuidando la eliminación de los desechos

potencialmente contaminados.

 Las mujeres embarazadas no deberán manipular los cultivos de L. monocytogenes bajo ninguna

circunstancia.

Establece el método microbiológico para determinar la presencia de L. monocytogenes a par tir de

alimentos para consumo humano nacionales o de importación.

C.1 INTRODUCCIÓN.

Este método permite determinar la presencia o ausencia de L. monocytogenes en los productos de

consumo, se efectúa por medio de un pre -enriquecimiento selectivo y después s u aislamiento en placas de

medio de cultivo selectivo y diferencial, con la confirmación mediante pruebas bioquímicas y fisiológicas.

L. monocytogenes es una bacteria que se desarrolla intracelularmente y es causante de Listeriosis. Es uno

de los patógenos más virulentos causante de infecciones alimentarias, con una tasa de mortalidad entre un

20% a 30%, más alta que casi todas las restantes tóxico infecciones alimentarias. L. monocytogenes es un

bacilo corto Gram positivo, que presenta diploformas dispuest as en “V” y anaerobio facultativo capaz de

proliferar en un amplio intervalo de temperaturas (1°C a 45°C). Es catalasa positiva y no presenta cápsula ni

espora. Tiene flagelos perítricos, gracias a los cuales presenta movilidad a 30°C o menos, pero es inmó vil a

37°C, temperatura a la cual sus flagelos se inactivan.

C.2 EQUIPO.

C.2.1 Autoclave y horno que alcance 180°C;

C.2.2 Balanza con sensibilidad de 0.1g;

C.2.3 Incubadoras a las diferentes temperaturas: 25°C ± 1°C, 30°C ± 1°C y 36°C ±1°C;

C.2.4 Potenciómetro;

C.2.5 Homogeneizador peristáltico o licuadora de una o dos velocidades controladas por un reóstato, con

vasos esterilizables (vidrio o aluminio);

C.2.6 Microscopio, y

C.2.7. Baño de agua a 45°C ± 2°C.

C.3 MATERIALES.

C.3.1 Asa de platino o níquel de 3mm de diámetro o 10µL;

C.3.2 Pipetas graduadas o pipetas automáticas, de diferentes capacidades 10mL, 5mL y 1mL con

divisiones de 0.5mL y 0.1mL respectivamente y protegidas con tapón de algodón;

C.3.3 Pipetas de 1mL, con graduaciones de 0.1mL;

C.3.4 Matraces Erlenmeyer de 500mL;

C.3.5 Cajas Petri de vidrio o desechables; diámetro 15mm x 90mm y/o de un diámetro mayor 140mm;

C.3.6 Cucharas, bisturíes, cuchillos y pinzas;

C.3.7 Tubos de ensaye de 16mm x 150mm y de 20mm x 100mm;

C.3.8 Tubos para serología de 10mm x 75mm o de 13mm x 100mm;

C.3.9 Gradillas para tubos de ensaye, y

C.3.10 Mecheros Bunsen o Fisher.

C.4 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS.

C.4.1 Caldo Fraser medio, con reducción de la concentración de agentes selectivos;

C.4.2 Caldo Fraser, con la completa concentración de agentes selectivos;

C.4.3 Agar Oxford;

C.4.4 Agar PALCAM;

C.4.5 ASTEL;

C.4.6 CSTEL;

C.4.7 Agar sangre de cordero;

C.4.8 Caldo carbohidrato (ramnosa y xilosa);

C.4.9 Agar movilidad, y

C.4.10 Solución de Peróxido de hidrógeno.

C.5 CEPAS.

C.5.1 S. aureus ATCC 49444, ATCC 25923, CIP 5710;

C.5.2 R. equi ATCC 6939, NCTC 1621;

C.5.3 L. monocytogenes ATCC 19115;

C.5.4 L. innocua ATCC 33090, y

C.5.5 L. ivanovii ATCC 19119.

C.6 CONDICIONES DE PRUEBA.

C.6.1 Muestreo.

Es importante que el laboratorio se cerciore de recibir una muestra representativa y que no haya tenido

daños o cambios durante el transporte y/o almacenamiento.

El muestreo no es parte del método especificado en el presente método, es recomendable que las partes

involucradas en este punto lleguen a un acuerdo al respecto.

C.6.2. Preparación de la muestra.

Al preparar la suspensión inicial, tomar diferentes porciones del alimento. Transferirlo al Caldo Fraser

medio, a fin de obtener una relación 1:10. Pesar 25g o mL a frascos de dilución c on 225mL del Caldo Fraser

medio, para obtener una dilución 1:10 (masa-volumen o volumen-volumen).

Homogeneizar por 1 min o 2 min en licuadora o homogeneizador peristáltico dependiendo del tipo de

alimento.

C.7 PROCEDIMIENTO ANALÍTICO.

C.7.1 Enriquecimiento Primario:

Incubar la suspensión inicial (C.6.2) a 30°C ± 1ºC por 24h ± 2h.

Nota: una coloración obscura puede aparecer, durante la incubación.

C.7.2 Enriquecimiento Secundario:

Transferir 0.1mL del enriquecimiento primario, después de la incubación inicia l por 24h ± 2h, a un tubo

conteniendo 10mL del Caldo Fraser.

Incubar el medio inoculado a 48h ± 2h a 36°C ± 1°C.

C.7.3 Siembra en medios selectivos e identificación.

Del enriquecimiento primario, después de las 24h ± 2h de incubación, inocular 2 placas de agar Oxford y 2

placas de PALCAM por estría cruzada.

Del enriquecimiento secundario incubado a 36°C ± 1°C por 48h ± 2h, inocular 2 placas con agar Oxford y 2

placas con PALCAM por estría cruzada.

Invertir las placas e incubar un juego de agar Oxford y PALCAM a 30°C ± 1°C y el otro a 36°C ± 1°C.

NOTA: Las placas con agar PALCAM se pueden incubar en condiciones de microaerofilia (CO 2 5% -12%

O2 5%-15%).

C.7.4 Después de la incubación por 24h; si se observa un crecimiento pobre o si no se observan colonias;

volver a incubar por 18h a 24h. Observar las placas para detectar la presencia de colonias presuntivas de

Listeria spp.

C.7.5 Colonias típicas de Listeria spp, en agar Oxford; por lo general crecen a las 24h se observan

pequeñas (1mm), grisáceas, rodeadas por un halo oscuro. Después de las 48h de incubación, las colonias se

tornan obscuras con posible brillo verdoso de aproximadamente 2mm de diámetro, con halos negros y centros

hundidos.

C.7.6 Colonias típicas de Listeria spp en agar PALCAM; para placas incub adas en anaerobiosis dejarlas

expuestas al aire por 1h, para que recuperen su color de rosa a púrpura. Después de 24h se observa a

Listeria spp como colonias muy pequeñas, grisáceas o un verde olivo de aproximadamente 1.5mm a 2mm de

diámetro, a veces con c entros negros, pero siempre con halos oscuros. Después de 48h las colonias de

Listeria spp se observan de color verde de aproximadamente 1.5mm a 2mm de diámetro, con el centro

hundido y rodeadas de un halo negro.

C.7.7 Pruebas Auxiliares Confirmatorias de Listeria spp.

C.7.7.1 Selección de Colonias para su confirmación: Tomar de cada placa de agares selectivos, 5

colonias sospechosas de Listeria spp. Si alguna de las placas tiene menos de 5 colonias presuntivas, tomar

para su confirmación todas las colonias que hayan crecido.

C.7.7.2 Aislamiento: Sembrar por estría cruzada, para obtener colonias aisladas en cajas con ASTEL.

Incubar estas placas a 36°C ± 1°C por 18h a 24h o hasta que el crecimiento sea satisfactorio (no más de 72h).

Las colonias típicas se ob servan de 1mm a 2mm de diámetro, convexas, incoloras y opacas con borde

entero. Si no se obtiene un buen aislamiento, proceder a sembrar nuevamente otra colonia sospechosa de los

medios selectivos.

C.7.7.3 Luz de Henry: Esta prueba tiene carácter informativo. Examinar las placas de ASTEL con colonias

típicas, con el sistema óptico de Henry se trata de hacer incidir luz transmitida oblicuamente con una lámpara

de luz blanca lo suficientemente potente como para iluminar la placa en un ángulo de 45°. Las colon ias

aparecen de color azul -gris a azul. Se recomienda el uso de cepas (positivo y negativo). La placa puede ser

observada a simple vista pero es preferible el uso de un microscopio de disección o lupa.

Nota: La luz de Henry puede ser mejor percibida si ASTEL es delgado aproximadamente 15mL/placa.

C.7.7.4 Reacción de Catalasa: Tomar una colonia aislada y suspenderla en una gota de solución de

peróxido de hidrógeno. La inmediata formación de burbujas indica una reacción positiva.

Precaución: la agitación d el reactivo con la suspensión del microorganismo debe hacerse con un asa de

plástico o palillo de madera estéril, evitando el contacto con el reactivo.

C.7.7.5 Tinción de Gram: Realizar la tinción de Gram a 1 colonia aislada obtenida en ASTEL, se deberán

observar bacilos cortos Gram Positivos.

C.7.7.6 Prueba de Movilidad: Tomar 1 colonia aislada de ASTEL, y suspenderla en un tubo conteniendo

CST con extracto de levadura. Incubar a 25°C ± 1ºC por 8h a 24h o hasta que se observe el medio turbio.

Depositar una gota de este cultivo entre un portaobjetos y cubreobjetos y examinar en el microscopio. Listeria

spp se observan como bacilos cortos con un movimiento giratorio (trumbling). Cultivos incubados a la

temperatura de 25°C ± 1ºC pueden ser falsos positivos al exhibir dicho movimiento: se recomienda siempre

comparar el cultivo de prueba con cepas conocidas de cocos, bacilos largos o cortos con una movilidad rápida

de nado y que no es característico de Listeria spp.

C.7.7.6.1. Prueba alternativa de movilidad: Utilizando un asa recta, inocular agar de movilidad picando 1

colonia obtenida en ASTEL. Incubar por 48h a 25°C ± 1ºC. Examinar el crecimiento alrededor de la picadura.

Debido al típico movimiento de Listeria spp como resultado un crecimiento característico e n forma de

sombrilla. Si el crecimiento no es suficiente, incubar por 5 días adicionales y observar la picadura al término

de ese tiempo.

C.7.8 Confirmación de L. monocytogenes.

C.7.8.1 Prueba de hemólisis: Si las características morfológicas y fisiológica s, así como la catalasa son

indicativos de Listeria spp, inocular una placa con agar sangre de carnero al 5% para determinar la actividad

hemolítica. Las placas de agar sangre no deben presentar agua de condensación en la superficie del medio.

Dibujar una cuadrícula de 20 a 25 espacios en el anverso de la placa de agar sangre de carnero al 5%. Tomar

1 colonia aislada obtenida en ASTEL e inocular por picadura un cuadro por cada cultivo a probar.

Simultáneamente utilizar cepas control positiva ( L. monocytogenes) y negativas ( L. innocua). Después de la

incubación a 36°C ± 1°C por 24h ± 2h, examinar las cepas de prueba y los controles. L. monocytogenes

produce una zona ligeramente clara alrededor del punto de la picadura ( -hemólisis); L. innocua no muestra

una zona clara alrededor de la picadura. L. ivanovii usualmente se observa una zona ancha, clara y delimitada

de -hemólisis. Examinar las placas con una luz brillante para poder comparar las cepas de prueba con los

controles.

C.7.8.2 Utilización de Carbohidratos (ramnosa y xilosa): Utilizando una asa bacteriológica, inocular

cada uno de los caldos de carbohidratos a probar usando colonias aisladas en ASTEL. Incubar a 36°C ± 1°C

por 5 días. Una reacció n positiva se caracteriza por la producción de ácido y cambio de color a amarillo

cuando se utiliza base caldo purpura de bromocresol adicionado con cada uno de los carbohidratos, que

ocurre dentro de las primeras 24h a 48h, si después de 48h de incubación no se observa una reacción

positiva clara, dejar incubar hasta 5 días (alternativamente pueden utilizarse sistemas de bioquímicas

miniaturizadas o métodos de biología molecular).

C.7.8.3 Prueba de CAMP: En una placa de agar sangre de carnero al 5% sembrar una estría de la cepa

de S. aureus y otra línea paralela de R. equi, de tal forma que queden paralelas y diametralmente opuestas

para que entre estas pueda estriarse la cepa sospechosa de Listeria, sin que lleguen a tocarse entre sí, (Ver

figura C.1). Sim ultáneamente probar cepas control: L. monocytogenes, L. innocua y/o L. ivanovii. Incubar las

placas a 36°C ± 1°C por 12h a 18h. Observar el sinergismo entre las hemólisis de S. aureus, R. equi y Listeria

que se manifiesta como una zona hemolítica intensa. La figura C.1 muestra la disposición de las estrías de los

cultivos en una placa de la prueba de CAMP. La hemólisis de L. monocytogenes y L. seeligeri se incrementa

cerca de la estría de S. aureus y la hemólisis de L. ivanovii se aumenta cerca de la estría de R. equi. Las

especies restantes de Listeria no son hemolíticas en esta prueba.

Figura C.1 Inoculación e Interpretación de la prueba de CAMP.

C.8 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.

C.8.1 Interpretación de las propiedades morfológicas y fisiológicas de las reacciones bioquímicas.

Todos las especies de Listeria spp son colonias pequeñas, bacilos Gram positivos con movilidad rotativa y

catalasa positiva. L. monocytogenes se distingue de otras especies por las características enlistadas en la

tabla C.1.

Para fines de vigilancia sanitaria, los aislamientos que sean considerados como L. monocytogenes deben

ser enviados al laboratorio de referencia CCAyAC de la COFEPRIS para realizar la tipificación.

Tabla C.1 Pruebas para la identificación de Listeria spp.

Especies Hemólisis Producción de ácido Prueba de CAMP

Ramnosa Xilosa S. aureus R. equi

L. monocytogenes + + - + -

L. innocua - V - - -

L. ivanovii + - + - +

L. seeligeri (+) - + (+) -

L. welshimeri - V + - -

L. grayi subsp. grayi - - - - -

L. grayi subs. murrayi - V - - -

V: reacción variable

(+): relación débil

+: > 90% de reacción positiva

-: sin reacción

Nota: Existen cepas extrañas de L. monocytogenes las cuales no muestran β -hemólisis o una reacción

positiva a la prueba de CAMP, bajo las condiciones descritas en el presente apéndice normativo C.

C.8.2 Cultivos Control.

C.8.2.1 Con el fin de comprobar la habilidad del pre -enriquecimiento y la identificación de Listeria spp, se

recomienda analizar junto con la prueba cepas control negativo como S. aureus y positivo como L.

monocytogenes.

C.8.3 Expresión de Resultados.

C.8.3.1 De acuerdo con la interpretación de los resultados, informar la presencia o ausencia de L.

monocytogenes, especificando la masa en g o el volumen en mL de la muestra ensayada.

C.9 Composición y preparación de medios de cultivo y reactivos.

C.9.1 Caldo Fraser Medio.

C.9.1.1 Medio Base.

Fosfato de sodio di básico

C.9.1.1.1 Fórmula.

Peptona de Carne

Triptona

Extracto de Carne de Res

Extracto de Levadura

Cloruro de Sodio

Fosfato de sodio monobásico di hidratado

Fosfato de Potasio di básico

Esculina

Agua

5.0g

5.0g

5.0g

5.0g

20.0g

12.0g

1.35g

1.0g

1000mL

C.9.1.1.2 Preparación: Disolver los componentes de la base en agua, calentando si es necesario. Ajustar

el pH, si es necesario para que después de la esterilización el pH se encuentre entre 7.2 ± 0.2 a 25°C.

Distribuir la base en matraces con capacidad apropiada para la prueba. Esterilizar por 1 5 min en la autoclave

a 121°C.

Nota: Se deberá adicionar la solución de cloruro de litio y la solución de ácido nalidíxico después de la

esterilización del medio base.

C.9.1.2 Solución de Cloruro de litio.

C.9.1.2.1 Fórmula.

Cloruro de litio

Agua

3.0g

10mL

C.9.1.2.2 Preparación: Adicionar el cloruro de litio al agua. Esterilizar por filtración.

Precauciones, la disolución de cloruro de litio en agua es fuertemente exotérmica e irritante a las mucosas.

C.9.1.3 Solución de ácido nalidíxico.

C.9.1.3.1 Fórmula.

Sales de ácido nalidíxico sódico

Solución de Hidróxido de sodio. 0,05 mol/L

0.1g

10mL

C.9.1.3.2 Preparación: Disolver las sales de ácido nalidíxico en la solución de hidróxido de sodio.

Esterilizar por filtración.

C.9.1.4 Solución de clorhidrato de acriflavina.

C.9.1.4.1 Fórmula.

Clorhidrato de acriflavina

Agua

0.25g

100mL

C.9.1.4.2 Preparación: Disolver el clorhidrato de acriflavina en una porción de agua. Esterilizar por

filtración.

C.9.1.5 Solución de citrato, amonio hierro III.

C.9.1.5.1 Fórmula.

Citrato de amonio hierro III

Agua

5.0g

100mL

C.9.1.5.2 Preparación: Disolver el Citrato de amonio hierro III en el agua. Esterilizar por filtración.

C.9.1.6 Medio Completo.

Solución de Cloruro de Litio 10mL de solución al 3%.

C.9.1.6.1 Fórmula.

Medio Base

Solución de Cloruro de Litio

Solución de ácido nalidíxico

Solución de clorhidrato de acriflavina

Solución de citrato, amonio hierro III

100mL

1.0mL

0.1mL

0.5mL

1.0mL

C.9.1.6.2 Preparación: Agregar las 4 soluciones por cada porción de 100mL de bas e inmediatamente

antes de usar.

C.9.2 Caldo Fraser.

C.9.2.1 Medio Base.

Fosfato de potasio monobásico.

C.9.2.1.1 Fórmula

Peptona de Carne

Triptona

Extracto de Carne de Res

Extracto de Levadura

Cloruro de Sodio

Fosfato de sodio monobásico dihidratado

Fosfato de Potasio dibásico

Esculina

Cloruro de litio

Sal de sodio o ácido nalidíxico

Agua

5.0g

5.0g

5.0g

5.0g

20.0g

12.0g

1.35g

1.0g

3.0g

0.02g

1000mL

C.9.2.1.2 Preparación: Disolver los componentes de la base en agua, puede usarse calentamiento.

Ajustar el p H, cuando se requiera para que después de la esterilización el pH se encuentre entre 7.2 ± 0.2 a

25°C. Distribuir la base en matraces con capacidad apropiada para la prueba. Esterilizar por 15 min en la

autoclave a 121°C.

C.9.2.2 Solución de clorhidrato de acriflavina.

C.9.2.2.1 Fórmula.

Clorhidrato de acriflavina

Agua

0.25g

100mL

C.9.2.2.2 Preparación: Disolver el clorhidrato de acriflavina en una porción de agua. Esterilizar por

filtración

C.9.2.3 Solución de citrato, amonio hierro III.

C.9.2.3.1 Fórmula.

Citrato de amonio hierro III

Agua

5.0g

100mL

C.9.2.3.2 Preparación: Disolver el Citrato de amonio hierro III en el agua. Esterilizar por filtración.

C.9.2.4 Medio Completo.

C.9.2.4.1 Preparación: Antes de usar añadir a cada tubo con 10mL del medio b ase 0.1mL de las

soluciones de Clorhidrato de acriflavina y solución de citrato de amonio hierro III. Mezclar vigorosamente.

C.9.3 Agar Oxford.

C.9.3.1 Agar Base.

C.9.3.1.1 Fórmula.

Peptonas

Almidón

Cloruro de sodio

23.0g

1.0g

5.0g

Agar

Esculina

Citrato de amonio, hierro III

Cloruro de Litio

Agua

De 9 a 18g(1)

0.8g

0.5g

15.0g

960mL

(1) Dependiendo de la fuerza gel del agar.

C.9.3.1.2 Preparación: Disuelva los componentes o el medio deshidratado completo en agua hirviendo.

Ajuste el pH si es necesario pa ra que después de la esterilización el pH se encuentre entre 7.2 ± 0.2 a 25°C.

Esterilizar por 15 min en la autoclave a 121°C.

C.9.3.2 Suplemento para 1000mL del Agar Oxford.

C.9.3.2.1 Fórmula.

Cicloheximida

Sulfato de Colistina

Clorhidrato de Acriflavina

Cefotetán

Fosfomicina

Etanol

Agua

400mg

20mg

5.0mg

2.0mg

10mg

5.0mL

5.0mL

C.9.3.2.2 Preparación: Disuelva los componentes o el medio deshidratado completo en una mezcla de

etanol-agua. Esterilizar por filtración.

C.9.3.3 Medio completo.

C.9.3.3.1 Preparación: Enfriar la base a aproximadamente 47°C y agregue el suplemento asépticamente.

Vierta el medio en cajas Petri, en aproximadamente 15mL. Almacene el medio en oscuridad, evite el contacto

con la luz.

C.9.4 Agar PALCAM.

C.9.4.1 Agar Base.

C.9.4.1.1 Fórmula.

Peptonas

Almidón

Cloruro de Sodio

Extracto de Levadura

Agar

Glucosa

Manitol

Esculina

Cloruro de Litio

Citrato de amonio, hierro III

Rojo de fenol

Agua

23.0g

1.0g

5.0g

3.0g

12.0g a 20.0g

0.5g

10.0g

0.8 a 1.0g

15.0g

0.5g

0.08g

1000mL

C.9.4.1.2 Preparación: Disolver los componentes de la base en agua, calentando si es necesario. Ajustar

el pH, si es necesario para que después de la esterilización el pH se encuentre entre 7.2 ± 0.2 a 25°C.

Dispensar la base en matraces con capacidad apropiada para la pru eba. Esterilizar por 15 min en la autoclave

a 121°C.

C.9.4.2 Solución de Sulfato de Polimixina B.

C.9.4.2.1 Fórmula.

Sulfato de Polimixina B (100, 000 UI)

Agua

0.1g

100mL

C.9.4.2.2 Preparación: Disolver el Sulfato de Polimixina B en agua. Esterilizar por filtración.

C.9.4.3 Solución de clorhidrato de acriflavina.

C.9.4.3.1 Fórmula.

Clorhidrato de acriflavina

Agua

0.05g

100mL

C.9.4.3.2 Preparación: Disolver el Clorhidrato de acriflavina en agua. Esterilizar por filtración.

C.9.4.4 Solución de Ceftazidima sódica pentahidratada.

C.9.4.4.1 Fórmula.

Ceftazidima sódica pentahidratada

Agua

0.116g

100mL

C.9.4.4.2 Preparación: Disuelva la Ceftazidima Sódica Pentahidratada en agua. Esterilice por

filtración.

C.9.4.5 Medio completo.

C.9.4.5.1 Fórmula.

Base Agar PALCAM

Solución de Sulfato de Polimixina B

Solución de Clorhidrato de acriflavina

Solución de Ceftazidima sódica pentahidratada

960mL

10mL

10mL

2mL

C.9.4.5.2 Preparación: A la base de agar fundida a 45°C agregar las 3 soluciones, mencionadas en la

fórmula, mezclar vigorosamente entre cada adición. Para la preparación en placa añadir al número apropiado

de cajas Petri aproximadamente 15mL del medio completo recién preparado, permita solidificar. Almacene el

medio lejos de la luz.

C.9.5 Agar ASTEL.

C.9.5.1 Fórmula.

Extracto de levadura

Agar

Agua

6.0g

de 9 a 18g(2)

1000mL

Triptona

Peptona de Soya

Cloruro de sodio

(2) Dependiendo de la fuerza del agar

17.0g

3.0g

5.0g

C.9.5.2 Preparación: Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en agua h irviendo.

Ajustar el pH si es necesario a modo que después de la esterilización sea de 7.3 ± 0.2 a 25°C. Esterilice por

15 min en autoclave a 121°C. Dispensar en cajas Petri aproximadamente 15mL y dejar solidificar.

C.9.6 CSTEL.

C.9.6.1 Fórmula.

Extracto de levadura

Agua

6.0g

1000mL

Triptona

Peptona de Soya

Cloruro de sodio

Fosfato de potasio

Glucosa

17.0g

3.0g

5.0g

2.5g

2.5g

C.9.6.2 Preparación: Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en agua hirviendo.

Ajustar el pH de ser necesario a modo que después de la esterilización sea de 7.3 ± 0.2 a 25°C. Vierta el

medio en matraces, frascos o tubos de capacidad apropiada para las pruebas. Esterilice por 15 min en

autoclave a 121°C.

C.9.7 Agar Sangre de cordero.

C.9.7.1 Fórmula.

Peptona de carne

Digerido de hígado

Extracto de levadura

Cloruro de sodio

Agar

Agua

Sangre de Cordero Desfibrada

15g

2.5g

5g

5g

de 9g a 18g(1)

1000mL

5mL a 7mL

(1) Dependiendo de la fuerza del agar

C.9.7.2 Preparación: Disuelva los componentes en agua hirviendo co n excepción de la sangre. Ajustar el

pH si es necesario a modo que después de la esterilización sea de 7.2 ± 0.2 a 25°C vierta el medio en

matraces de capacidad apropiada, para las pruebas. Esterilice por 15 min en autoclave a 121°C. Agregar la

sangre desfibrinada a la base previamente atemperada a 47°C, mezclar bien. Vierta el medio en cajas Petri en

proporciones adecuadas para las pruebas, permita solidificar.

C.9.8 Caldo Carbohidratos (Ramnosa y Xilosa).

C.9.8.1 Medio Base.

C.9.8.1.1 Fórmula.

Proteasa de Peptona

Extracto de Carne

Cloruro de sodio

Purpura de Bromocresol

Agua

10g

1g

5g

0.02g

1000mL

C.9.8.1.2 Preparación: Disuelva los componentes en agua, calentar si es necesario. Ajustar el pH a modo

que después de la esterilización sea de 6.8 ± 0.2 a 25°C . Vierta el medio en tubos de capacidad apropiada,

para las pruebas. Esterilice por 15 min en autoclave a 121°C.

C.9.8.2 Solución de Carbohidrato.

C.9.8.2.1 Fórmula.

Carbohidrato (L-Ramnosa o D-Xilosa)

Agua

5g

100mL

C.9.8.2.2 Preparación: Disuelva por s eparado cada carbohidrato en 100mL de agua, esterilizar por

filtración.

C.9.8.3 Medio Completo.

C.9.8.3.1 Preparación: En condiciones asépticas para cada carbohidrato adicionar 10mL de solución del

carbohidrato a 90mL de la base.

C.9.9 Agar de Movilidad.

C.9.9.1 Fórmula.

Peptona de Caseína

Peptona de Carne

Agar

Agua

20.0g

6.1g

3.5g

1000mL

C.9.9.2 Preparación: Disuelva los componentes en agua hirviendo. Ajustar el pH si es necesario a modo

que después de la esterilización sea de 7.3 ± 0.2 a 25°C. Vierta el medio en tubos en cantidades de 5mL y

esterilice por 15 min en autoclave a 121°C.

C.9.10 Solución de Peróxido de Hidrógeno.

C.9.10.1 Preparación: Utilizar diez volúmenes de solución al 3% volumen/volumen.