Apéndice D — NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos.

Apéndice D Normativo.

Método alternativo para la estimación de Enterococos fecales en agua. Técnica de tubos múltiples.

D.1 INTRODUCCIÓN.

Este grupo fue separado del resto de los enterococos fecales debido a que son indicadores relativamente

específicos de contaminación fecal. Sin embargo, algunos enteroc ocos intestinales aislados de agua, pueden

ocasionalmente tener un origen de otras fuentes, incluyendo suelos aun en ausencia de contaminación fecal.

El grupo enterococo intestinal puede ser usado como un índice de contaminación fecal.

Los enterococos inte stinales son relativamente tolerantes al NaCl y pH alcalino. La mayoría de las

especies no se multiplican en agua.

La ventaja de este grupo sobre otros grupos indicadores (coliformes y E. coli) es que sobreviven durante

más tiempo en medios acuáticos.

La p resencia de enterococos intestinales evidencia una contaminación fecal reciente, así como la

necesidad de llevar a cabo acciones en aquellas fuentes de abastecimiento con un inadecuado tratamiento de

potabilización.

En la presente Norma se describen 3 técn icas para cuantificar y estimar la presencia de enterococos en

agua para uso y consumo humano, agua envasada y hielo, agua de uso recreativo (dulce y salobre): 1.

Técnica de filtración por membrana, 2. Técnica del NMP y 3. Técnica del sustrato cromogénico definido.

La técnica de NMP es un método de estimación probabilística de la densidad bacteriana presente en una

muestra, basada en la dilución de la misma y sembrada en réplicas de tubos con caldo selectivo (caldo azida

dextrosa), en los cu ales después de un peri odo de incubación de 24h - 48h a 35°C ± 0.5°C, se observa la

presencia de turbiedad en cada tubo.

La prueba confirmativa consiste en sembrar cada uno de los tubos que presenten turbiedad, en medio

selectivo para enterococos de Pfizer. Después de un periodo de incubación, las colonias de color café a negro

y un halo café debido a la hidrólisis de la esculina, son sembradas en caldo BHI con 6.5% de NaCl e

incubadas a 45°C ± 0.5°C. El desarrollo en este medio confirma la presencia de enterococos.

D.2 MATERIALES.

D.2.1 Botellas de dilución de vidrio de boro silicato o frascos de polipropileno;

D.2.2 Pipetas serológicas de 10mL;

D.2.3 Pipetas serológicas de 1mL;

D.2.4 Asas bacteriológicas;

D.2.5 Tubos de ensaye de 16mm x 150mm con tapón de rosca;

D.2.6 Cajas Petri de vidrio de borosilicato o plástico estériles de 100mm x 150mm;

D.2.7 Propipeta, y

D.2.8 Gradillas.

D.3 APARATOS E INSTRUMENTOS.

D.3.1 Incubadora que evite variaciones mayores de ± 0.5ºC con termómetro calibrado o verificado;

D.3.2 Autoclave;

D.3.3 Balanza granataria con sensibilidad de al menos 0.1g;

D.3.4 Horno para esterilizar, y

D.3.5 Baño de agua a 45°C ± 0.2°C.

D.4 MEDIOS DE CULTIVO.

D.4.1 Caldo azida dextrosa;

D.4.2 ABEA, y

D.4.3 BHI

D.5 PROCEDIMIENTO ANALÍTICO.

D.5.1 MEDIDAS DE SEGURIDAD.

Seguir las indicaciones precautorias que se señalan en el apartado de preparación de medios de cultivo.

D.5.2 MEDIDAS DE CONTROL DE CALIDAD.

El laboratorio debe tener implementado un sistema de control de calidad para asegurar que los materiales,

equipos, reactivos, medios de cultivo y técnicas sean adecuados para la prueba.

D.5.3 ÍNDICES DE REPRODUCIBILIDAD Y REPETIBILIDAD.

Basado en una distribución normal, el 95% de las medias de cada grupo de resultados analíticos deben

estar entre +2 y -2 desviaciones estándar con respecto a la media de las medias.*

La precisión del analista deberá estar dentro de un 5%*.

*Fuente: Manual of food quality control 12. Quality assurance in the food control microbiological laboratory.

Food and Agriculture Organization (FAO).

D.5.4 RECOMENDACIONES GENERALES PREVIAS AL ANÁLISIS DE LA MUESTRA.

Homogeneización de la muestra. - Las muestras en frascos con un espacio vacío (de al menos 2.5cm),

pueden homogeneizarse por inversión rápida veinticinco veces. Las muestras en frascos que t engan de 2/3 a

3/4 de lleno, deberán agitarse 25 movimientos de arriba abajo en un arco de 30cm completados en un tiempo

de 7s, para asegurar una unidad analítica representativa.

D.5.5 CONDICIONES DE PRUEBA.

Trabajar en condiciones asépticas en un área lim pia y descontaminada. Todo el material que esté en

contacto con la muestra debe estar estéril.

D.5.6 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA.

Descontaminar el exterior de los contenedores de la muestra con etanol o isopropanol al 70%. Realizar

diluciones decimales cuando se estime que la carga de enterococos es alta.

D.5.7 Prueba presuntiva.

D.5.7.1 El tamaño de la porción de muestra analizada dependerá de su tipo (agua para uso y consumo

humano, agua envasada y hielo, agua de fuentes de abastecimiento y aguas de uso rec reativo dulce y

salobre). Utilizar 5 porciones de 20mL o 10 porciones de 10mL inoculados a tubos con caldo azida dextrosa

(consultar la sección de medios de cultivo para las concentraciones). Incubar a 35°C ± 0.5°C por 24h ± 2h. La

presencia de turbiedad e n los tubos debida al desarrollo microbiano, se considera como prueba presuntiva

positiva.

D.5.8 Prueba confirmativa.

D.5.8.1 A partir de cada tubo con turbiedad, transferir una asada a placas de ASPE. Incubar las placas

invertidas a 35°C ± 0.5°C por 24h ± 2h. El desarrollo de colonias de color café oscuro a negro con halos cafés,

confirman la presencia de estreptococos fecales.

Transferir al menos una colonia característica por tubo a tubos con caldo BHI con 6.5% de NaCl a 35°C ±

0.5°C por 48h ± 4h y caldo BHI a 45°C ± 0.5°C por 24h ± 2h. El crecimiento en ambos medios confirma la

presencia de enterococos.

D.5.9 Cálculos.

D.5.9.1 Calcular la densidad de enterococos por el NMP en 100mL con el número de tubos confirmados

consultando las Tablas 1 o 2.

Tabla D. 1 Número más probable por 100mL de muestra de agua o hielo con un intervalo de confianza del

95%, utilizado 5 tubos con 20mL de muestras.

No. De Tubos

positivos

NMP/100mL 95% de Límite de Confianza (aproximado)

Inferior Superior

0 <1.1 - 3.5

1 1.1 0.051 5.4

2 2.6 0.40 8.4

3 4.6 1.0 13

4 8.0 2.1 23

5 >8.0 3.4 -

Referencia: American Public Health Association. Standard Methods for the Examination of Water and

Wastewater. 21th edition 2005. Washington DC.

Tabla D.2 Número más probable por 100mL de muestra e intervalos de confianza del 95% utilizado 10 tubos

con 10mL de muestras.

No. de tubos positivos NMP/100mL Límite de confianza

Inferior Superior

0 <1.1 - 3.4

1 1.1 0.051 5.9

2 2.2 0.37 8.2

3 3.6 0.91 9.7

4 5.1 1.6 13

5 6.9 2.5 15

6 9.2 3.3 19

7 12 4.8 24

8 16 5.8 34

9 23 8.1 53

10 >23 13 -

Referencia: American Public Health Association. Standard Methods for the Examination of Water and

Wastewater. 21th edition 2005. Washington DC.

D.5.9.2 Considerar en el resultado final la(s) dilución(es) realizadas.

D.5.9.3 Para el caso de agua para uso recreativo utilizar cinco tubos con Caldo azida dextrosa por cada

porción de 10mL, 1mL y 0.1mL de muestra. Para inóculos de 10mL de agua, preparar el medio a doble

concentración y para volúmenes de 1mL y 0.1mL a concentración sencilla. Hacer diluciones decimales de la

muestra cuando se considere necesario con solución reguladora de fosfatos o agua peptonada. Incubar a

35°C ± 0.5°C por 24h a 48h. La presencia de turbiedad en los tubos debida al desar rollo microbiano, se

considera como prueba presuntiva positiva. Continuar como se indica para la prueba confirmativa.

D.5.9.4 Calcular la densidad total del grupo Enterococos por el NMP en 100mL con el número de tubos

confirmados consultando la Tabla D.3.

Tabla No. D.3 NMP para 100mL de muestra cuando se usan 5 porciones en cada una de tres

diluciones con series geométricas.

No. de Tubos Positivos No. de Tubos Positivos No. de Tubos Positivos No. de Tubos Positivos No. de Tubos Positivos No. de Tubos Positivos

10mL 1 mL 0.1Ml NMP 10mL 1 mL 0.1mL NMP 10mL 1 mL 0.1mL NMP 10mL 1 mL 0.1mL NMP 10mL 1 mL 0.1mL NMP 10mL 1 mL 0.1mL NMP

0 0 0 <1,8 1 0 0 2 2 0 0 4,5 3 0 0 7,8 4 0 0 13 5 0 0 23

0 0 1 1,8 1 0 1 4 2 0 1 6,8 3 0 1 11 4 0 1 17 5 0 1 31

0 0 2 3,6 1 0 2 6 2 0 2 9,1 3 0 2 13 4 0 2 21 5 0 2 43

0 0 3 5,4 1 0 3 8 2 0 3 12 3 0 3 16 4 0 3 25 5 0 3 58

0 0 4 7,2 1 0 4 10 2 0 4 14 3 0 4 20 4 0 4 30 5 0 4 76

0 0 5 9,0 1 0 5 12 2 0 5 16 3 0 5 23 4 0 5 36 5 0 5 95

0 1 0 1,8 1 1 0 4 2 1 0 6,8 3 1 0 11 4 1 0 17 5 1 0 33

0 1 1 3,6 1 1 1 6,1 2 1 1 9,2 3 1 1 14 4 1 1 21 5 1 1 46

0 1 2 5,5 1 1 2 8,1 2 1 2 12 3 1 2 17 4 1 2 26 5 1 2 64

0 1 3 7,3 1 1 3 10 2 1 3 14 3 1 3 20 4 1 3 31 5 1 3 84

0 1 4 9,1 1 1 4 12 2 1 4 17 3 1 4 23 4 1 4 35 5 1 4 110

0 1 5 11 1 1 5 14 2 1 5 19 3 1 5 27 4 1 5 42 5 1 5 130

0 2 0 3,7 1 2 0 6,1 2 2 0 9,3 3 2 0 14 4 2 0 22 5 2 0 49

0 2 1 5,5 1 2 1 8,2 2 2 1 12 3 2 1 17 4 2 1 26 5 2 1 70

0 2 2 7,4 1 2 2 10 2 2 2 14 3 2 2 20 4 2 2 32 5 2 2 95

0 2 3 9,2 1 2 3 12 2 2 3 17 3 2 3 24 4 2 3 38 5 2 3 120

0 2 4 11 1 2 4 15 2 2 4 19 3 2 4 27 4 2 4 44 5 2 4 150

0 2 5 13 1 2 5 17 2 2 5 22 3 2 5 31 4 2 5 50 5 2 5 180

0 3 0 5,6 1 3 0 8,3 2 3 0 12 3 3 0 17 4 3 0 27 5 3 0 79

0 3 1 7,4 1 3 1 10 2 3 1 14 3 3 1 21 4 3 1 33 5 3 1 110

0 3 2 9,3 1 3 2 13 2 3 2 17 3 3 2 24 4 3 2 39 5 3 2 140

0 3 3 11 1 3 3 15 2 3 3 20 3 3 3 28 4 3 3 45 5 3 3 180

0 3 4 13 1 3 4 17 2 3 4 22 3 3 4 31 4 3 4 52 5 3 4 210

0 3 5 15 1 3 5 19 2 3 5 25 3 3 5 35 4 3 5 59 5 3 5 250

0 4 0 7,5 1 4 0 11 2 4 0 15 3 4 0 21 4 4 0 34 5 4 0 130

0 4 1 9,4 1 4 1 13 2 4 1 17 3 4 1 24 4 4 1 40 5 4 1 170

0 4 2 11 1 4 2 15 2 4 2 20 3 4 2 28 4 4 2 47 5 4 2 220

0 4 3 13 1 4 3 17 2 4 3 23 3 4 3 32 4 4 3 54 5 4 3 280

0 4 4 15 1 4 4 19 2 4 4 25 3 4 4 36 4 4 4 62 5 4 4 350

0 4 5 17 1 4 5 22 2 4 5 28 3 4 5 40 4 4 5 69 5 4 5 430

0 5 0 9,4 1 5 0 13 2 5 0 17 3 5 0 25 4 5 0 41 5 5 0 240

0 5 1 11 1 5 1 15 2 5 1 20 3 5 1 29 4 5 1 48 5 5 1 350

0 5 2 13 1 5 2 17 2 5 2 23 3 5 2 32 4 5 2 56 5 5 2 540

0 5 3 15 1 5 3 19 2 5 3 26 3 5 3 37 4 5 3 64 5 5 3 920

0 5 4 17 1 5 4 22 2 5 4 29 3 5 4 41 4 5 4 72 5 5 4 1600

0 5 5 19 1 5 5 24 2 5 5 32 3 5 5 45 4 5 5 81 5 5 5 >1600

Referencia: AOAC 18 ° Edición. Revisión 2, 2007.

D.5.10 Interpretación de resultados.

El crecimiento en ambos medios caldo BHI con 6.5% de NaCl incubado a 35°C ± 0.5ºC y en caldo BHI a

45°C ± 0.5°C confirma la presencia de enterococos fecales.

D.6 Criterios de validez de la prueba.

Esta prueba tiene validez cuando todos los tubos de la menor dilución sean positivos y todos los tubos de

la dilución mayor sean negativos o la combinación de ambos cuando la muestra contenga enterococos o

cuando se trate de un cultivo control inoculado con 100 UFC.

D.7 Informe de prueba.

Informar como: Enterococos NMP/100mL.

D.8 MEDIOS DE CULTIVO.

Añadir el siguiente pá rrafo: De preferencia utilizar medios de cultivo comerciales. Seguir las instrucciones

del fabricante para almacenar y eliminar después de su preparación. Si los medios de cultivo se deben

preparar a partir de los ingredientes básicos, seguir las indicaciones descritas a continuación.

D.8.1 Caldo azida dextrosa*.

D.8.1.1 Fórmula.

INGREDIENTES

CANTIDAD

Concentración

1x

Concentración

2x

Concentración

3x

Concentración

6x

1mL o 0.1mL de

muestra con 10mL

de caldo

10mL muestra con

10mL de caldo

20mL muestra con

10mL de caldo

100mL muestra con

20mL de caldo

Extracto de Carne 4.5g 9.0g 13.5g 27.0g

Triptona o polipeptona 15.0g 30.0g 45.0g 90.0g

Glucosa 7.5g 15.0g 22.5g 45.0g

NaCI 7.5g 15.0g 22.5g 45.0g

Azida de Sodio, NaN3, 0.2g 0.4g 0.6g 1.2g

Agua 1L 1L 1L 1L

D.8.1.2 Preparación: Disolver los ingredientes en 1L de agua. Esterilizar a 121°C durante 15min. El pH

después de la esterilización debe ser de 7,2 ± 0,2 a 25°C.

*PRECAUCIÓN: La azida de sodio es tóxica y mutagénica. Manejar con precaución y evitar e l contacto

con este compuesto. Puede formar compuestos explosivos si tiene contacto con metal.

D.8.2 ABEA.

D.8.2.1 Fórmula.

Ingredientes Cantidad

Peptona C (Triptona) 17.0g

Peptona B (Proteosa peptona No. 3) 3.0g

Extracto de Levadura 5.0g

Bilis bacteriológica 10.0g

Cloruro de Sodio 5.0g

Citrato de Sodio 1.0g

Esculina 1.0g

Citrato Férrico amónico 0.5g

Azida de Sodio, NaN3 0.15g

Agar 15.0g

Agua 1.0L

D.8.2.2 Preparación: Disolver los ingredientes en 1L de agua. Esterilizar a 121°C durante 15min. El pH

después de la esterilización debe ser de 7.1 ± 0.2 a 25°C. Dejar enfriar y mantener el medio no más de 4h

antes de vaciarlo a una temperatura de 45°C a 50°C.

*PRECAUCIÓN: La azida de sodio es tóxica y mutagénica. Manejar con precaución y evitar el contacto

con este compuesto. Puede formar compuestos explosivos si tiene contacto con metal.

D.8.3 BHI con 6.5% de NaCI.

D.8.3.1 Fórmula.

Ingredientes Cantidad

Infusión de cerebro de ternera a partir de 200.0g 7.7g

Infusión de corazón de res a partir de 250.0g 9.8g

Proteosa peptona 10.0g

Glucosa 2.0g

Cloruro de sodio NaCl 65.0g

Fosfato disódico hidrogenado Na2HPO4 2.5g

Agua 1L

D.8.3.2 Preparación: Disolver los ingredientes en 1L de agua. Distribuir en tubos de ensaye. Esterilizar a

121°C durante 15 min. El pH después de la esterilización debe ser de 7.4 ± 0.2.