Apéndice J — NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos.

Apéndice J Normativo.

Método para la Enumeración de E. coli -glucuronidasa a 44°C utilizando 5-Bromo-4-cloro-3-Indol -

D-Glucurónido.

ADVERTENCIA - Las cepas de E. coli, que no crecen a 44ºC y en particular, los que son -glucuronidasa

negativas, como E. coli O:157, no serán detectadas.

J.1. INTRODUCCIÓN.

El medio TBX presenta la ventaja con respecto a otros medios de cultivo, al haber adicionado un agente

cromógeno X-glucurónido, el cual detecta la actividad de la enzima glucuron idasa que es altamente específica

de E. coli . Al contrario de lo que sucede con el MUG en donde el fluróforo liberado por la célula queda

atrapado dentro del agar y es requisito evidenciarlo con ayuda de luz UV de onda larga (365nm), la liberación

del cromóforo en el medio TBX es insoluble y se acumula dentro de la misma célula. Esto asegura que sea

más fácil la detección de colonias típicas de E. coli debido a que adquieren cierta coloración característica. La

mayoría de los biotipos de E. coli , se podrán diferenciar de otros coliformes, debido a la presencia de la

enzima glucuronidasa.

El cromógeno en el medio TBX es el 5 -bromo-4-cloro-3-indol--D-glucurónido (X -glucurónido), y es el

blanco de esta enzima. Las células de E. coli son capaces de absorber est e complejo intacto y la

glucuronidasa intracelular rompe los enlaces entre el cromóforo y la glucuronidasa. El cromóforo liberado tiene

un color propio y se queda atrapado dentro de la célula, provocando que las colonias de E. coli se observen

de color azul sin la necesidad de interpretar con iluminación de luz UV de onda larga.

J.2 EQUIPO:

J.2.1 Incubadora capaz de operar a 44°C ± 1°C;

J.2.2 Baño de agua capaz de mantener una temperatura de 44°C a 47°C;

J.2.3 Incubadora capaz de operar a 35°C ± 2°C, y

J.2.4 Homogeneizador peristáltico o licuadora.

J.3 MATERIALES:

J.3.1 Tubos de Ensaye;

J.3.2 Matraces;

J.3.3 Botellas;

J.3.4 Micropipetas y Pipetas de 1mL,10mL graduadas respectivamente en 0.1mL y 0.5mL, y

J.3.5 Cajas Petri de aproximadamente 90mm de diámetro.

J.4 MEDIOS DE CULTIVO.

J.4.1 TBX.

J.5 CONDICIONES DE PRUEBA.

J.5.1 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA DE ENSAYO.

J.5.1.1 Tomar diferentes porciones del alimento, transferir 25g o mL a frascos de dilución conteniendo

225mL de agua peptonada amortiguada. Realizar diluciones seriadas si es necesario. En una situación atípica

y justificada, si la porción de muestra utilizada en el ensayo es distinta a 25g o mL, se deberá utilizar la

cantidad necesaria de agua peptonada amortiguada para obtener una dilución 1:10.

J.5.1.2 Dependiendo de la naturaleza del producto homogenizar por 1 min o 2 min en Licuadora o agitador

peristáltico.

J.5.1.3 El tiempo que transcurre entre el final de la preparación de la suspensión inicial y el momento en

que el inóculo entra en contacto con el medio de cultivo no debe exceder de 45min.

J.5.2 INOCULACIÓN E INCUBACIÓN.

J.5.2.1 Utilizando una pipeta estéril o micropipeta con puntas estériles, transferir por duplicado a placas

Petri 1mL de la muestra (muestras líquidas) o 1mL de cada dilución prep arada. Inocular por duplicado en

cajas Petri.

J.5.2.2 Adicionar en cada caja Petri aproximadamente 15mL del medio TBX previamente fundido y

mantenido en un baño de agua entre 40°C y 50°C.

J.5.2.3 Homogenizar el inóculo mediante 6 movimientos de derecha a i zquierda, 6 en el sentido de las

manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrás a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta

lograr una completa incorporación del inóculo en el medio. Dejar solidificar.

Nota: El tiempo que transcurre entre el inóculo en la caja Petri y adicionar el medio de cultivo no debe

exceder de 15 min.

J.5.2.4 Invertir las placas e incubar por un periodo inicial de 4h a 35°C ± 2°C e incubar inmediatamente a

44°C ± 1°C durante 18h a 20h. El tiempo total de incubación no debe exceder 24h.

Nota: La temperatura de incubación no debe exceder 45°C.

J.6 CUENTA DE UFC.

Después del periodo de incubación contar las colonias típicas como -glucuronidasa positiva, colonias

azules.

J.7 EXPRESIÓN DE RESULTADOS.

J.7.1 CÁLCULOS.

Nota: Para que el resultado sea válido, es necesario que al menos una de las placas contadas tenga 15

UFC típicas (Colonias azules).

Seleccionar las placas que contienen menos de 150 UFC típicas ( E. coli -glucuronidasa positiva) y en

total no tener más de 300 UFC (típicas y no típicas).

Calcular N, como el número de UFC de E. coli -glucuronidasa positiva, presente en la muestra por mL o

g, como la media de dos diluciones sucesivas utilizando la siguiente ecuación:

N =  .

V(n1 + 0.1 n2) d

Dónde:

= Es la suma de las UFC contenidas en todas las placas por duplicado, donde al menos una cumpla

con el criterio de tener 15 colonias típicas.

= Es el número de placas inoculadas para la primera dilución.

= Es el volumen del inóculo, en mL, inoculados en cada Placa Petri.

= Es el número de placas inoculadas para la segunda dilución.

Es el factor de dilución correspondiente a la primera dilución (d= 1 en el caso de productos líquidos,

donde la muestra es directamente inoculada)

Redondear el resultado a números enteros utilizando dos cifras significativas.

Tomar el número resultante como las UFC de E. coli -glucuronidasa positiva, por mL o por g de producto.

Ejemplo: Se analizó fruta picada para la búsqueda de E. coli -glucuronidasa positiva. Se o btienen los

siguientes resultados:

Dilución Colonias contadas en Placa “a” Colonias contadas en Placa

“b”

1:10 125 109

1:100 21 16

Aplicando la fórmula anterior y sustituyendo los valores se obtiene:

N=

de E. coli -glucuronidasa positiva.

Nota: Redondear a 2 cifras significativas.

J.7.2 ESTIMACIÓN DE NÚMEROS BAJOS.

J.7.2.1 Si las placas Petri contienen menos de 15 colonias típicas, calcular el N E el número de UFC de E.

coli -glucuronidasa positiva presente en la muestra, como la media aritmética de dos placas paralelas

utilizando la siguiente ecuación:

NE = c .

(V) (n) (d)

Dónde:

Es la suma de las UFC típicas de las dos placas.

= es el volumen del inóculo, en mL para cada placa.

= es el número de placas Petri utilizadas en el recuento (n=2 en este caso).

= es el factor de dilución de la suspensión inicial o la primera dilución inoculada (d = 1 en el caso de

productos líquidos) donde la muestra es inoculada directamente.

Redondear el resultado a dos cifras significativas.

Expresar los resultados como sigue:

- Número estimado de UFC E. coli -glucuronidasa positiva por mL o g.

Ejemplo: En un brote alimenticio se analizó carne de hamburguesa mal cocida para la búsqueda de E. coli

-glucuronidasa positiva. Se obtienen los siguientes resultados.

Dilución Colonias contadas Placa “a” Colonias contadas Placa “b”

1:10 5 7

Aplicando la fórmula anterior y sustituyendo los valores se obtiene:

Reportar como:

60* UFC/g de E. coli -glucuronidasa positiva.

* Valor estimado.

J.7.2.2 Si dos placas i noculadas directamente con la muestra de prueba o con la dilución inicial; no se

observa crecimiento de colonias azules; expresar los resultados como sigue:

- Menos que 1/d de E. coli -glucuronidasa positiva por mL o g.

Donde d es el factor de dilución de la dilución inicial (d= 1 en el caso de productos líquidos los cuales son

inoculados directamente en la caja Petri).

Por ejemplo: si no se encuentran colonias en ninguna dilución y la primer dilución es 1:10 entonces

reportar como menos que 1/0.1 es decir < 10 UFC g o mL de E. coli -glucuronidasa positiva.

J.7.2.3 Si la cuenta de colonias típicas y atípicas en la primera dilución es mayor de 300, pudiendo

discernir colonias azules y en la siguiente dilución la cuenta de típicas y atípicas es menor de 300 colonias sin

ninguna colonia típica azul, expresar los resultados como sigue:

- Menor que 1/d2 y mayor que 1/d1 E. coli -glucuronidasa positiva por mL o g. Donde d1 y d2 son los

factores de dilución correspondientes a los factores de dilución de la primer a y segunda dilución

respectivamente.

Por ejemplo: En la dilución 1:10 se cuenta más de 300 colonias y se observan algunas colonias azules, y

en la segunda dilución (1:100) se cuentan 33 colonias pero ninguna colonia típica azul.

Entonces se tiene < 1/0.01 y > 1/0.1 por lo tanto: < 100UFC/g y > 10UFC/g de E. coli -glucuronidasa

positiva.

J.7.2.4 Si en la primera dilución d1 el total de colonias típicas y atípicas es mayor de 300 sin discernir

colonias azules y para la subsecuente dilución d2 contiene menos de 300 colonias sin poder contar alguna

colonia azul, expresar los resultados como sigue:

- Menos que 1/d2 UFC E. coli -glucuronidasa positiva por mL o g.

Dónde: d2 es el factor de dilución correspondiente a la segunda dilución.

Por ejemplo: Para la dilu ción 1:10 se cuentan más de 300 colonias de las cuales no se distinguen las

colonias típicas de las atípicas y en la dilución 1:100 se cuentan 35 colonias; sin ninguna colonia típica azul.

Entonces se tiene < 1/1:100 por lo tanto reportar como: < 100 UFC/g o mL de E. coli -glucuronidasa

positiva.

J.7.3 CALCULOS PARA CASOS ESPECIALES.

J.7.3.1 En el caso donde el número de UFC típicas azules es mayor de 150 para el duplicado de la

primera dilución d1 y con un número menor de 15 UFC para el duplicado de la segunda dilución d2:

- Si la cuenta de UFC típicas azules en cada uno de los duplicados de la primer dilución se

encuentra dentro del rango de 150 a 167 (siendo el límite superior del intervalo de confianza de una

media igual a 150), utilizar la fórmula del caso J.7.1:

- Si la cuenta de colonias típicas azules en cada una de las placas por duplicado de la dilución d1

es mayor que 167 (siendo el límite superior del intervalo de confianza de una media igual a 150), se

TOMARÁ EN CUENTA S ÓLO el resultado de las c uentas de d2 (la mayor dilución) y aplicar la

fórmula para cuentas bajas del punto J.7.2.

J.7.3.2 En el caso donde la cuenta de colonias típicas azules en cada una de las placas, de cada dilución

sea mayor a 150, expresar el resultado como sigue:

- Mayor que 150/d2 E. coli -glucuronidasa positiva/mL o g.

Donde d2 es el factor de dilución para la última dilución inoculada (la mayor dilución).

Por ejemplo:

Dilución 1:10

Placa 1: >150 colonias típicas azules Placa 2: >150 colonias típicas azules.

Dilución 1:100

Placa 1: 162 colonias típicas azules Placa 2: 186 colonias típicas azules

Entonces se tiene > 150UFC/0.01 por lo tanto reportar como:

> 15 000UFC/g o mL de E. coli -glucuronidasa positiva.

* Valor estimado

J.7.3.3 En el caso donde s ólo el duplicado dé la más baja dilución (o alta concentración de muestra)

contiene menos de 150 colonias típicas azules, calcular el número de E. coli -glucuronidasa positiva presente

en la muestra de prueba como la media aritmética del total de colonias de las dos plac as, utilizando la

siguiente ecuación:

N´ = c .

(V)(n)(d)

Donde:

Es la suma de las UFC típicas de las dos placas, de las cuales al menos una contiene 15 UFC

típicas.

= Es el volumen del inóculo, en mL para cada placa.

= Es el número de placas Petri utilizadas en el recuento (n=2 en este caso).

= Es el factor de dilución de la suspensión inicial o la primera dilución inoculada.

Redondear el resultado a dos cifras significativas.

Por ejemplo:

10-1 = Placa 1: 85 colonias Placa 2: 76 colonias

10-2= Placa 1: 0 colonias Placa 2: 0 colonias

N´ = 85+76 .

(1mL) (2)(0.1)

N´ = 161/0.2 = 805UFC/g  800 UFC/g de E. coli -glucuronidasa positiva.

J.8 FORMULACIONES Y PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.

J.8.1 TBX.

J.8.1.1 Composición.

Digerido Enzimático de Caseína (Triptona) 20.0g

Sales biliares no. 3. 1.5g

X-glucurónido 0.075g

Agar de 9g a 18ga

Agua 1000mL

a Dependiendo de la fuerza del agar.

J.8.1.2 Preparación.

Disolver el X -glucoronido en el diluyente recomendado por el f abricante. Disolver todos los componentes

en agua y calentar a ebullición.

Ajustar el pH, si es necesario, para que después de la esterilización éste se encuentre en 7.2 ± 0.2 a 25°C.

Esterilizar el medio en la autoclave a 121°C por 15min. Inmediatamente e nfriar el medio en un baño de

agua mantenido de 44°C a 47°C.

J.8.2 AGUA PEPTONADA AMORTIGUADA

J.8.2.1 Fórmula.

Digerido enzimático de caseína

(triptona)

10.0g

NaCl 5.0g

Na2HPO4.12H2O 9.0g

KH2PO4 1.5g

Agua 1 000mL

J.8.2.2 Preparación: Disolver los ing redientes en el agua, calentar si es necesario. Ajustar el pH, de tal

manera que después de la esterilización sea 7.0 ± 0.2 a 25°C. Distribuir el medio en frascos de capacidad

necesaria para obtener las porciones de prueba. Esterilizar en autoclave 15 min a 121°C.

__________________________________