Apéndice I — NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos.

Apéndice I normativo.

Método aprobado para la estimación de la densidad de E. c oli por la técnica del NMP, para

productos de la pesca.

Este método es aplicable para pescados y productos de la pesca como: pescados crudos, enteros o filetes

sin piel y cabeza, pescado salado, seco, ahumado, cefalópodo entero o en rebanada, crustáceos en tero como

langostas, cangrejo, gasterópodos, bivalvos, caracoles, procesados pescados y crustáceos moluscos como:

secos, ahumados, marinados, troceado, horneado, pescado entero o filetes con o sin piel cocidos, surimi,

crustáceos enteros y moluscos en su c oncha, congelados, pescado, entero, filetes y piezas, cangrejo,

cefalópodos, moluscos en concha cocidos y caracoles en concha.

I.1 INTRODUCCIÓN.

Este método consta de dos etapas. La primera es un enriquecimiento mediante la inoculación de la

muestra previamente homogeneizada y diluida en cinco tubos por dilución, en caldo glutamato con minerales

modificado e incubado a 37 °C ± 1°C por 24h. La segunda es la confirmación de la presencia de E. coli

mediante la resiembra de tubos en los que se observe producción de ácido en agar que contenga 5-bromo-4-

cloro-3-indol-â-D glucuronido y detectar la actividad de â-glucuronidasa incubado a 44°C ± 1°C por 22h ±2h.

I.2 EQUIPO.

I.2.1 Homogeneizador peristáltico y bolsas;

I.2.2 Motor homogeneizador rotatorio y vasos de licuadora;

I.2.3 Gabinete de flujo laminar (clase II);

I.2.4 Refrigerador a 3°C ± 2°C;

I.2.5 Material de vidrio estéril;

I.2.6 Cuchillos desconchadores, tijeras, pinzas, espátulas estériles;

I.2.7 Mechero Bunsen;

I.2.8 Guantes de látex;

I.2.9 Incubadora a 37°C ±1°C y a 44°C ± 1°C;

I.2.10 Asas bacteriológicas;

I.2.11 Pipetas de 1mL, 2mL y 10mL;

I.2.12 Martillo, y

I.2.13 Desconchador.

I.3 MATERIALES.

I.3.1 Cajas Petri desechables 15mm x 100mm;

I.3.2 Tubos de ensaye 18mm x 200mm y de 16mm x160mm con tapón de rosca;

I.3.3 Botellas de dilución de vidrio de borosilicato con tapa de rosca;

I.3.4 Botellas de 500mL esterilizables;

I.3.5 Termómetros de máximas cuya precisión/exactitud no sea mayor a 1°C.Se deberá registrar la

inspección trimestral de la columna de mercu rio del termómetro con una lupa en búsqueda de rupturas de la

misma, si se observa alguna, éste deberá salir de uso, y

I.3.6 Termómetro de inmersión total de 379mm de longitud de 25°C a 55°C, una escala auxiliar a 0°C con

subdivisiones de 0.1°C con una precisión y exactitud de ± 0.1°C.

Se deberá registrar la inspección anual de la columna de mercurio del termómetro con una lupa en

búsqueda de rupturas de la misma, si se observa alguna, éste deberá salir de uso.

I.4 REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO.

I.4.1 Etanol;

I.4.2 Agua peptonada al 0.1% (concentración simple);

I.4.3 MMGB medio selectivo de enriquecimiento;

I.4.4 TBGA, y

I.4.5 Tween 80.

I.5. CULTIVOS DE REFERENCIA.

I.5.1 E. coli ATCC 25922 o ATCC 8739, y

I.5.2 E. faecalis ATCC 29212 o ATCC 19433.

I.6 PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS.

I.6.1 Procedimientos generales. Todas las preparaciones de las muestras deben llevarse a cabo en

condiciones asépticas con materiales estériles y evitar contaminaciones de fuentes externas.

I.6.2 Productos congelados. Los productos co ngelados deben permitir que obtengan una consistencia

adecuada para ser muestreados en el laboratorio, almacenados de 18°C a 27°C (temperatura del laboratorio)

por máximo de 3h o a 2°C ± 2°C por 24h. Las muestras deben ser analizadas tan rápido como sea po sible

después de este paso. Si el producto todavía está congelado, tomar una porción del diluyente a temperatura

del laboratorio y adicionar para facilitar la descongelación.

I.6.3 Productos secos y duros. No homogeneizar en un homogeneizador rotatorio por más de 2.5 min.

Para productos secos y duros heterogéneos, puede ser necesario picarlos o moler la muestra por no más

de 2.5 min para evitar el aumento de temperatura.

I.6.4 Productos líquidos no viscosos. Antes de analizar la muestra agitar manualmente veinticinco veces

en un arco de 30cm durante 7s o por medios mecánicos para asegurar la distribución homogénea de los

microorganismos.

I.6.5 Productos heterogéneos. Para las muestras que contienen diferentes piezas de alimentos,

muestrear varias alícuotas r epresentativas de las diferentes porciones del producto. También se puede

homogeneizar toda la muestra recibida en el laboratorio y tomar una porción analítica de este homogeneizado.

Para lo cual puede ser necesario picar o moler por más de 1 min para evit ar sobrecalentamiento de la

muestra.

I.6.6 Productos ácidos. Cuando se analicen productos ácidos es necesario llevar el pH a la neutralidad.

El uso de un diluyente con un indicador de pH puede evitar el uso de tiras reactivas de pH. Para lo cual es

necesario adicionar NaOH (0.1Mplar) y ajustar cuando el indicador cambie de coloración.

I.6.7 Alimentos altos en grasa (aproximadamente sobre el 20% de grasa). Usar diluyente con Tween

80 entre 1 y 10mg/L de acuerdo al contenido de grasa mejora la emulsificación de la suspensión.

I.6.8 Pescado fresco entero. Las áreas de las branquias, el intestino y el ano deben ser cubiertas con

algodón estéril empapado de alcohol al 70%. Tomar porciones cúbicas del músculo dorsal y moler con el

diluyente.

I.6.9 Rebanadas y file te de pescado. Tomar una porción representativa de la muestra y diluir 1 + 9 de

diluyente.

I.6.10 Cefalópodos enteros y en rebanadas. Remover la piel y las ventosas con pinzas y bisturí. Tomar

porciones cúbicas del músculo dorsal y porciones de los tentácu los. Adicionar diluyente necesario para tener

una dilución 1:10. La carne de los cefalópodos es relativamente firme, moler con el diluyente con

homogeneizador rotatorio o cortar en piezas finas.

I.6.11 Crustáceos enteros como cangrejos. Utilizar martillo, pinzas para romper la concha y tenazas

para extraer la cantidad máxima de carne para el análisis. Adicionar el diluyente y moler con homogeneizador

rotatorio. Alternativamente se puede cortar en piezas finas y colocarlo en doble bolsa de homogeneizador

peristáltico para evitar derrames durante la homogeneización.

I.6.12 Carne de crustáceo en concha. Tomar una porción necesaria para tener una suspensión 1:10 y

homogeneizar.

I.6.13 Crustáceos como gambas, langostinos y langostas. Remover la cabeza y la cola a ntes del

análisis de la carne del cuerpo. Excepto para animales pequeños cortar la carne en piezas. Homogeneizar en

licuadora. Adicionar la cantidad necesaria de diluyente para tener una dilución 1:10.

I.6.14 Moluscos bivalvos, gasterópodos y otros. Las muestras en el laboratorio deben ser almacenadas

a 4°C ±2°C. Los moluscos deben estar vivos. Desechar los moluscos con las conchas abiertas o dañadas.

Una muestra representativa debe contener al menos 6 conchas individuales que deberán ser

aproximadamente 75g a 100g (25g para animales pequeños). La muestra de bivalvos debe contener carne y

líquido intervalvar (licor). Abrir la cantidad necesaria de moluscos para tener la cantidad suficiente de muestra

para el método.

I.6.14.1 Bivalvos. Lavar y cepillar cada c oncha con agua potable corriente, especialmente del músculo

abductor o bisagra. Colocar los bivalvos en una charola con un papel absorbente. Con un cuchillo

desconchador estéril, insertar la punta entre las valvas y hacer palanca para cortar el músculo abd uctor y abrir

la concha. Penetrar sobre la concha superior y drenar el licor y la carne en un vaso de precipitados estéril.

Adicionar una parte de carne y licor (agua intervalvar) y dos partes de diluyente y homogeneizar en

homogeneizador rotatorio por 30s a 2 min. De esta manera se obtiene una suspensión 1:2 de diluyente, puede

adicionarse la cantidad necesaria para obtener una dilución 1:9.

I.6.14.2 Gasterópodos. Lavar y cepillar cada concha, lavarlas con al alcohol al 70%, romper la concha

con un martill o para extraer el animal. Preparar una dilución 1:2 en diluyente y posteriormente completar el

volumen a una dilución 1:10.

I.6.14.3 Erizos de mar. Lavar seis piezas individualmente con agua potable corriente y colocarlos en una

charola estéril. Sostener l os animales con unas pinzas y con un guante apropiado cortar una pieza del lado

ventral con unas tijeras afiladas. Colectar la carne y en fluido en un contenedor estéril para homogeneizarlo.

Preparar una dilución 1:2 con diluyente y después una cantidad ne cesaria para tener una dilución 1 + 9 con el

mismo diluyente.

I.6.15 Productos salados y encurtidos. Tomar tiras del producto para obtener el homogeneizado. En

caso de que sea muy salado es necesario diluir más de 1:10.

I.6.16 Pescado seco. Con unas tijeras cortar piezas del cuerpo del pescado incluyendo la piel. Preparar 1

suspensión 1:2 con el diluyente y homogeneizar en un motor de licuadora, adicionar la cantidad suficiente

para tener una dilución 1:10 usando el mismo diluyente.

I.6.17 Pescado seco y sa lado. Prepara la muestra igual que para el pescado seco. Si es necesario

rehidratar la muestra con agitación por 60min de 18°C a 27°C.

I.6.18 Pescado ahumado entero. Si el pescado se come entero, incluir en la muestra la piel, si no se

come entero excluir la piel.

I.6.19 Pescado ahumado en filetes o rebanadas con o sin piel. Tomar porciones en cubo de la muestra

retirando la piel.

I.6.20 Productos marinados. Para productos acidificados bajar el pH a 6 – 7.

I.6.21 Pescados empanizados, surimi, crustáceos y m oluscos delicatesen. Tomar porciones

representativas de la muestra y diluir 1:10.

I.6.22 Platillos con pescado, crustáceos y moluscos cocidos. Tomar una porción de cada

componente. Homogeneizar toda la muestra para tomar una muestra analítica.

I.6.23 Gasterópodos cocidos. Tomar una porción del cuerpo del animal con pinzas y diluir 1:10.

I.6.24 Langostinos en concha congelados en bloque. Descongelar poco a poco por 1h a 18°C - 27°C

(temperatura ambiente) para que el bloque se pueda romper, extraer los langos tinos con pinzas estériles.

Mezclar las piezas con un homogeneizador peristáltico.

I.6.25 Bloques congelados de carne de cangrejo en hojuelas. Descongelar poco a poco por 1h a 18°C

- 27°C (temperatura ambiente) para que el bloque se pueda romper, extraer t rozos con pinzas estériles.

Mezclar con el diluyente con un homogeneizador rotario.

I.6.26 Cefalópodos enteros congelados en bloque. Descongelar poco a poco por 1h a 18°C -27°C

(temperatura ambiente) para que el bloque se pueda romper, extraer con pinzas o tijeras estériles. Mezclar las

piezas con un homogeneizador rotario.

I.6.27 Filetes de pescado congelado en bloques. Tomar una muestra perforando el bloque o permitir

que se descongele de 18°C a 27°C por 1h y tomar porciones con pinzas estériles o dejar que se descongele lo

suficiente por no más de 3h para tomar porciones con pinzas estériles.

I.6.28 Piezas grandes de pescado congelado en bloques. Descongelar poco a poco por 1h a 18°C -

27°C para que el bloque se pueda romper, rebanar con cuchillo bien afilado estéril por la mitad del bloque.

I.6.29 Porciones pequeñas de pescado congeladas individuales. Descongelar poco a poco por 1h a

18°C - 27°C (temperatura ambiente). Tratar la muestra como un producto fresco.

I.6.30 Atún entero congelado. Si el atún es descongelado tomar una pieza del músculo debajo de la piel

usando un cuchillo estéril. Si el atún no se descongela usar un perforador. Pescado congelado y piezas de

pescado congelado. Descongelar poco a poco por no más de 3h a 18°C -27°C (temperatura ambie nte) o

descongelar en el refrigerador de 0°C a 4°C por máximo de 48h o tomar piezas con un perforador evitando los

huesos si es posible.

I.6.31 Preparación de diluciones decimales. Transferir 1mL de la suspensión inicial a un tubo con 9mL

de diluyente estéril.

NOTA: Si es necesario tener un volumen más grande de la suspensión inicial (más de 1mL) adicionar

nueve partes del diluyente empleado. Introducir la pipeta no más de 1cm de profundidad. Utilizar una pipeta

para cada dilución. Mezclar perfectamente ent re cada dilución preferentemente usando un agitador mecánico

para obtener una dilución 10 -2. Si es necesario repetir la operación con una pipeta nueva diferente para

obtener 10 -3, 10 -4 etc. hasta obtener la dilución apropiada y obtener la cantidad de micro organismos

necesaria. Se deberán realizar suficientes diluciones decimales para obtener resultados negativos.

I.6.32 Duración del proceso. El tiempo inicial entre la preparación de la suspensión y el momento final

cuando el inóculo entre en contacto con el medio no debe ser mayor a 45 min, mientras que el límite de

tiempo entre la preparación de la suspensión inicial y el comienzo de las diluciones decimales siguientes no

debe ser mayor a 30 min.

I.7 MEDIOS DE CULTIVO.

I.7.1 Agua peptonada al 0.1% (concentración simple);

I.7.2 Caldo glutamato con minerales modificado (MMGB medio selectivo de enriquecimiento), y

I.7.3 Agar bilis glucuronido (TBGA sundo medio selectivo).

I.8 PROCEDIMIENTO, INOCULACIÓN DEL ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO.

I.8.1 En caso general inocul ar tres tubos por cada dilución. Para moluscos vivos, u otros productos

especiales y/o cuando sea necesario obtener resultados más exactos es necesario inocular series de cinco

tubos por dilución. Tomar tres tubos de medios de enriquecimiento selectivo. Co n una pipeta estéril transferir

10mL de la muestra líquida o 10mL de la suspensión original en caso de otros productos. Tomar tres tubos de

concentración simple de medios de enriquecimiento selectivo, usando otra pipeta estéril, transferir a cada uno

de es tos tubos 1mL de la muestra líquida o 1mL de la suspensión en caso de otros productos. Realizar

diluciones decimales y repetir los puntos anteriores para cada dilución. Mezclar cuidadosamente el inóculo y el

medio.

I.8.2 Incubar a 37°C ± 1°C por 24h ± 2h.

I.8.3 Para cada tubo inoculado que muestre presencia coloración amarilla estriar con un asa a una placa

de agar triptona bilis glucuronido para obtener colonias aisladas.

I.8.4 Incubar las placas a 44°C ± 1°C por 24h ± 2h.

I.8.5 Después del periodo de incu bación, observar la presencia de colonias de cualquier tono azul

(obscuro o pálido), indican la presencia de -glucuronidasa positivo de E. coli.

I.9 INTERPRETACIÓN.

I.9.1 Considerar como positivo cada tubo del cual se obtenga n colonias azules a azules-verdes en la placa

del medio selectivo. Contar por cada dilución el número de tubos positivos en el medio.

I.10 EXPRESIÓN DE RESULTADOS.

I.10.1 Calcular el NMP a partir del número de tubos positivos por cada dilución consultando las Tablas I.1

o I.2 dependiendo de la serie de tubos que se utilice. Considerar la cantidad de gramos de muestra en cada

dilución e informar por 100g de molusco o por g para productos de la pesca en general.

I.11 PRECISIÓN.

I.11.1 La técnica del NMP tiene amplias variaciones en los resultados en series de tres tubos por dilución.

Por lo que los resultados obtenidos deben ser usados con precaución. Cuando se use las series de cinco

tubos, se debe de reportar con la precisión obtenida la cual es comparable c on los métodos de cuenta de

colonias. Los límites de confianza se encuentran en las tablas (I.1, I.2).

Ejemplo.

Para una combinación de tubos positivos de 3 -3-2 se tendría una lectura de 24NMP/g en un intervalo de

confianza de 95% de 9.8 a 70 E. coli glucoronidasa positiva.

Para una combinación de tubos positivos de 5 -2-1 se tendría una lectura de 70NMP/g en un intervalo de

confianza de 95% de 22 a 170 E. coli glucoronidasa positiva.

I.12 INFORME DE PRUEBA.

I.12.1 El informe debe especificar:

I.12.1.1 Toda la información necesaria y completa para la identificación de la muestra;

I.12.1.2 El método de muestreo usado, si se conoce;

I.12.1.3 El método de prueba usado;

I.12.1.4 Todos los detalles no especificados en la técnica, y

I.12.1.5 Los resultados obtenidos y/o si la repetitividad se ha realizado.

Tabla I.1. Número más probable por gramo de muestra e intervalo de confianza del 95%, utilizando 3 tubos con 0.1, 0.01

y 0.001 g de muestra

Tubos positivos NMP/g Límite de confianza Tubos positivos NMP/g Límite de confianza

0.1 0.01 0.001 Inferior Superior 0.1 0.01 0.001 Inferior Superior

0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42

0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94

0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94

0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94

0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94

0 3 0 9.4 3.8 38 3 0 0 23 4.6 94

1 0 0 3.8 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110

1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180

1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180

1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200

1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420

1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420

1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420

1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420

2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430

2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1000

2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1000

2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2000

2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4100

2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 --

Tabla I.2. Número más probable por gramo de muestra e intervalo de confianza del 95%, utilizando 5 tubos con 0.1, 0.01

y 0.001 g de muestra

Tubos positivos NMP/g Límite de confianza Tubos positivos NMP/g Límite de confianza

0.1 0.01 0.001 Inferior Superior 0.1 0.01 0.001 Inferior Superior

0 0 0 <1.8 -- 6.8 4 0 2 21 6.8 40

0 0 1 1.8 0.09 6.8 4 0 3 25 9.8 70

0 1 0 1.8 0.09 6.9 4 1 0 17 6 40

0 1 1 3.6 0.7 10 4 1 1 21 6.8 42

0 2 0 3.7 0.7 10 4 1 2 26 9.8 70

0 2 1 5.5 1.8 15 4 1 3 31 10 70

0 3 0 5.6 1.8 15 4 2 0 22 6.8 50

1 0 0 2 0.1 10 4 2 1 26 9.8 70

1 0 1 4 0.7 10 4 2 2 32 10 70

1 0 2 6 1.8 15 4 2 3 38 14 100

1 1 0 4 0.7 12 4 3 0 27 9.9 70

1 1 1 6.1 1.8 15 4 3 1 33 10 70

1 1 2 8.1 3.4 22 4 3 2 39 14 100

1 2 0 6.1 1.8 15 4 4 0 34 14 100

1 2 1 8.2 3.4 22 4 4 1 40 14 100

1 3 0 8.3 3.4 22 4 4 2 47 15 120

1 3 1 10 3.5 22 4 5 0 41 14 100

1 4 0 11 3.5 22 4 5 1 48 15 120

2 0 0 4.5 0.79 15 5 0 0 23 6.8 70

2 0 1 6.8 1.8 15 5 0 1 31 10 70

2 0 2 9.1 3.4 22 5 0 2 43 14 100

2 1 0 6.8 1.8 17 5 0 3 58 22 150

2 1 1 9.2 3.4 22 5 1 0 33 10 100

2 1 2 12 4.1 26 5 1 1 46 14 120

2 2 0 9.3 3.4 22 5 1 2 63 22 150

2 2 1 12 4.1 26 5 1 3 84 34 220

2 2 2 14 5.9 36 5 2 0 49 15 150

2 3 0 12 4.1 26 5 2 1 70 22 170

2 3 1 14 5.9 36 5 2 2 94 34 230

2 4 0 15 5.9 36 5 2 3 120 35 250

3 0 0 7.8 2.1 22 5 2 4 150 58 400

3 0 1 11 3.5 23 5 3 0 79 22 220

3 0 2 13 5.6 35 5 3 1 110 34 250

3 1 0 11 3.5 26 5 3 2 140 52 400

3 1 1 14 5.6 36 5 3 3 180 70 400

3 1 2 17 6 36 5 3 4 210 70 400

3 2 0 14 5.7 36 5 4 0 130 36 400

3 2 1 17 6.8 40 5 4 1 170 58 400

3 2 2 20 6.8 40 5 4 2 220 70 440

3 3 0 17 6.8 40 5 4 3 280 100 710

3 3 1 21 6.8 40 5 4 4 350 100 710

3 3 2 24 9.8 70 5 4 5 430 150 1100

3 4 0 21 6.8 40 5 5 0 240 70 710

3 4 1 24 9.8 70 5 5 1 350 100 1100

3 5 0 25 9.8 70 5 5 2 540 150 1700

4 0 0 13 4.1 35 5 5 3 920 220 2600

4 0 1 17 5.9 35 5 5 4 1600 400 4600

5 5 5 >1600 700 --

I.13. MEDIOS DE CULTIVO.

I.13.1 Agua peptonada al 0.1% (concentración simple).

Peptona babteriológica (Oxoid LPP37) 1.0±0.1g

Agua deionizada 1L

pH 7.0 ± 0.2

I.13.1.1 Preparación: Suspender los ingredientes en 1L de agua destilada. Dejar en reposo durante 5 min

a 10 min. Mezclar bien, agitando frecuentemente, hasta completar la disolución. Ajustar el pH.

I.13.2 Caldo glutamato con minerales modificado (MMGB medio selectivo de enriquecimiento).

Ingredientes Doble concentración Concentración simple

Glutamato de sodio (Oxoid L124) 12.7g 6.35g

Lactosa 20.0g 10.0g

Formato de sodio 0.5g 0.25g

L-Cisteína 0.04g 0.02g

L(-) Acido aspártico 0.048g 0.024g

L(+) - Arginina 0.04g 0.02g

Tiamina 0.002g 0.001g

Ácido nicotínico 0.002g 0.001g

Ácido pantogénico 0.002g 0.001g

Sulfato de magnesio septahidratado 0.2g 0.1g

Citrato de fierro III 0.02g 0.01g

Cloruro de calcio dihidratado 0.02g 0.01g

Fosfato dipotásico 1.8g 0.9g

Púrpura de bromocresol 0.02g 0.01g

Cloruro de amonio 5.0g 2.5g

Agua destilada 1000mL 1000mL

I.13.2.1 Preparación: Disolver el cloruro de amonio en agua. Adicionar el resto de los componentes hasta

su completa disolución y calentar si es necesario. Para mejorar la estabilidad del almacenamiento del medio.

Adicionar el glutamato de sodio por separado. Ajustar el pH si es necesario, así como después de la

esterilización el cual debe de ser de 6.7 ± 0.1 a 25°C. Distribuir el medio en volúmenes de 10mL en caso de

concentración simple y tubos de 22mm x 175mm para el caso de concentración doble de medio. Esterilizar en

autoclave a 116°C. Alternativamente calentar a 100°C por 30 min en 3 días sucesivos.

I.13.3 Agar bilis glucuronido (TBGA segundo medio selectivo).

Digerido enzimático de caseína 20.0g

Sales biliares No.3 1.5g

5-Bromo-4-cloro-3-Indol-â-D- glucuronido ácido (BCIG) 144 µ mol (micro mol)a

Dimetil sulfoxido (DMSO) b 3mL

Agar 9gc a 18gc

Agua 1000mL

a Por ejemplo 0.075g de

b Dimetil sulfoxido es peligroso al inhalarlo y al contacto. Se recomienda el uso de cubrebocas para humos

y equipo de protección apropiado para manejar este reactivo.

c Depende de la concentración del gel el agar.

I.13.3.1 Preparación: Disolver el medio anterior en el dimetil sulfoxido. Disolver todos los componentes en

aguas calentando a ebullición. Ajustar el pH si es necesario, así como después de la esterilización el cual

debe de ser de 7.2 ± 0.2 a 25°C. Esterilizar el medio a 121°C por 15 min. Vaciar de 12mL a 15mL en placas

Petri estériles y dejar secar. Las placas pueden ser almacenadas a entre 3°C y 5°C hasta 5 días. El agar debe

estar lo suficientemente seco pasa permitir que el exceso de humedad desaparezca dentro de los 15 min

después de extender el inóculo.