Apéndice H — NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos.

Apéndice H Normativo.

Método aprobado para la estimación de la densidad de Coliformes totales, fecales y E. coli por la

técnica del NMP presentes en muestras de alimentos para consumo humano y agua.

Este método es aplicable para l a estimación de la densidad de coliformes totales, coliformes fecales y E.

coli por la técnica del NMP presentes en muestras de alimentos para consumo humano y agua.

Este método es aplicable para la detección de coliformes fecales y E. coli, especialmente en productos

que se encuentran en bajas concentraciones de microrganismos.

H.1 INTRODUCCIÓN.

Actualmente se utilizan 3 grupos de indicadores microbianos con diferentes aplicaciones. La detección de

bacterias del grupo coliforme se usan como indicador de la calidad sanitaria del agua o como indicador de las

condiciones sanitarias en el procesamiento de alimentos. Los coliformes totales, fecales y E. coli continúan

siendo el indicador de elección que manifiesta contaminación fecal reciente o condiciones higié nicas

inadecuadas. El método del NMP consiste de una prueba presuntiva y confirmativa. El uso de las series de

tres, cinco y diez tubos va a depender de la contaminación esperada y el grado de exactitud deseada.

El principio de la técnica se basa en la dilución de la muestra en tubos múltiples, de tal forma que todos los

tubos de la menor dilución sean positivos y todos los tubos de la dilución mayor sean negativos. El resultado

positivo se demuestra por la presencia de gas y crecimiento microbiano propieda d de los microorganismos

coliformes para producir gas a partir de la fermentación de lactosa a 45.5°C ± 0.2°C (para alimentos) 44.5°C ±

0.2°C (para agua) dentro de las 48h de incubación (coliformes fecales y E. coli).

Para obtener el NMP en los resultados se aplica la teoría de la probabilidad, lo cual tiene como condición

lo siguiente:

- Una distribución aleatoria de las bacterias que existen en la muestra.

- Las bacterias se encuentran como entidades no agrupadas.

- Los microorganismos presentes en la mue stra crecerán en el medio cuando son incubados y se

mantengan en las condiciones adecuadas para su desarrollo.

Alrededor del 96% de las cepas de E. coli incluso las cepas anaerogénicas producen la enzima beta-

glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato específico 4-metilumbelliferyl-beta-D-glucurónido (MUG) en 4-

metilumbelliferona (MU), que al ser expuesto a una fuente de luz UV de onda larga (365nm) produce una

fluorescencia azul, fácil de observar cuando el MUG es incorporado al caldo EC o al caldo lauril.

Una excepción es la E.coli enterohemorrágica serotipo O157:H7, que es GUD negativa; por lo que es

común que esta prueba se utilice para diferenciar este serotipo de las demás E. coli.

La producción de GUD por otras bacterias de la familia Enterobacteriaceae es rara. Algunas cepas o

especies de Shigella (44%-58%) y Salmonella spp (20% -29%) son GUD positivas, sin embargo no se

considera una desventaja de esta prueba para su uso en salud pública.

Si se espera una cuenta microbiana alta, la muestra deberá diluirse para dar cumplimiento a las

condiciones. La forma más común de realizar esta prueba es mediante diluciones decimales y usando un

inóculo en series de tubos. A medida que el número de tubos inoculados para cada dilución aumenta, se

reducen los límites de confianza.

H.2 EQUIPO.

H.2.1 Baño de agua c on cubierta y recirculación constante que alcance una temperatura de 44.5° C,

45.5°C ± 0.2 °C;

H.2.2 Lámpara de luz UV de 365nm longitud de onda;

H.2.3 Incubadora de aire que mantenga una temperatura de 35°C ± 0.5°C;

H.2.4 Balanza con capacidad adecuada y sensibilidad de 0.1g;

H.2.5 Motor de licuadora u homogenizador peristáltico;

H.2.6 Potenciómetro con sensibilidad de 0.1 de unidad de pH;

H.2.7 Mecheros Bunsen, y

H.2.8 Autoclave que mantenga una temperatur a interna de 121°C bajo una presión de 15 psi (1 bar),

equipado con termómetro calibrado y manómetro de presión calibrado, previamente calificada.

H.3 MATERIALES.

H.3.1 Tubos de cultivo de 18mm x 150mm, 18mm x 200mm, 16mm x 150mm, 16mm x 160mm, 22 x

175mm con tapón de rosca;

H.3.2 Tubos de fermentación (campanas de Durham);

H.3.3 Gradillas de plástico y metal;

H.3.4 Asas bacteriológicas;

H.3.5 Lentes protectores;

H.3.6 Termómetro de máximas para autoclave con división mínima de 0.5°C calibrado. Se deberá re gistrar

la inspección trimestral de la columna de mercurio del termómetro con una lupa en búsqueda de rupturas de la

misma, si se observa éste deberá salir de uso;

H.3.7 Termómetro de inmersión total de 379mm de longitud de 25°C a 55°C, una escala auxiliar a 0°C con

subdivisiones de 0.1°C con una precisión y exactitud de ± 0.1°C.

Se deberá registrar la inspección anual de la columna de mercurio del termómetro con una lupa en

búsqueda de rupturas de la misma, si se observa éste deberá salir de uso;

H.3.8 Cinta testigo para procesos de esterilización por calor húmedo;

H.3.9 Vasos de licuadora estéril o bolsas estériles para homogeneizador peristáltico;

H.3.10 Pipetas graduadas bacteriológicas de 0.1mL, 1mL, 2mL, 5mL y 10mL;

H.3.11 Probetas de 100mL, 500mL y 1000mL;

H.3.12 Frascos de dilución de vidrio de borosilicato con tapón esmerilado;

H.3.13 Frascos con capacidad 500mL con tapa de rosca, y

H.3.14 Espátulas, cucharas, cuchillos, pinzas.

H.4. MEDIOS DE CULTIVO.

H.4.1 Caldo A-1;

H.4.2 Caldo lauril Triptosa;

H.4.3 Caldo EC;

H.4.4 EMB-L;

H.4.5 Caldo triptona al 1%;

H.4.6 Caldo RM – VP;

H.4.7 Caldo Citrato de Koser;

H.4.8 Citrato de Simmon;

H.4.9. Caldo Lauril triptosa con MUG;

H.4.10 Caldo Verde Brillante Lactosa Bilis;

H.4.11 Agar Mc Conkey;

H.4.12 Agar Nutritivo;

H.4.13 Agar Cuenta Estándar, y

H.4.14 Caldo Lauril con MUG.

H.5. REACTIVOS.

H.5.1 Regulador de fosfatos solución concentrada;

H.5.2 Diluyente de peptona al 0.1%;

H.5.3 Reactivo de Kovac;

H.5.4 Reactivo de VP;

H.5.5 Indicador rojo de metilo, y.

H.5.6 Reactivos para la coloración de Gram.

H.6 CEPAS DE REFERENCIA

H.6.1 E. coli ATCC 25922, y

H.6.2 Enterobacter aerogenes ATCC 13048.

H.7 PROCEDIMIENTO ANALÍTICO.

H.7.1 Procedimiento para determinar coliformes Totales, Fecales y E. coli en agua y hielo.

H.7.1.1 Prueba presuntiva. Agitar vigorosamente la muestra veinticinco veces en un arco de 30° por 7s, la

cantidad necesaria para el análisis deberá ser de 100mL como mínimo e inocular el caldo lauril triptosa a la

concentración adecuada, como se describe en el punto H.14.1.2.

H.7.1.1.1 Agua para uso y consumo humano y envasada. Transferir 5 porciones de 20mL, 10 mL o una

porción de 100mL. Consultar la tabla H.14.1.2, para seleccionar las diferentes concentraciones de caldo lauril

de acuerdo a los diferentes volúmenes de muestra a inocular.

H.7.1.1.2 Agua para uso recreativo. Utilizar cinco tubos de caldo lauril por cada porción de 10mL, 1mL y

0.1mL, hacer diluciones decimales cuando se espere una densidad microbiana alta. Consultar las Tablas

H.14.1.2.

H.7.1.1.3 Hielo. Fundir por completo el hielo a 45°C y realizar el análisis como agua para uso y consumo

humano. Incubar los tubos de caldo lauril inoculados a 35 °C ± 0.5°C por 24h a 48 h. Examinar los tubos a las

24h y observar si hay evidente formación de gas. Si no se observa la formación de gas, incubar 24h más y

anotar los resultados.

H.7.1.2 Prueba confirmativa. De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una asada y sembrar en

un número igual de tubos de Caldo EC para la prueba confirmativa; inocular en tub os de EC un control

positivo de E. coli y un control negativo de Enterobacter aerogenes e incubar con las muestras.

H.7.1.3 Incubar los tubos para prueba de coliformes totales a 35 °C ± 0.5°C por 48h ± 2h y para la prueba

de coliformes fecales a 45.5 °C ± 0.2°C en baño de agua con recirculación continua durante 24h, observar si

hay formación de gas, registrar la lectura, en caso de no haber formación de gas, incubar 24h más. Utilizar

estos resultados para calcular el NMP de Coliformes totales y coliformes fec ales respetivamente. Consultar la

sección de cálculos.

Nota: Para todos los alimentos que se les determine coliformes fecales, la incubación debe ser a 45.5°C ±

0.2°C por 24h a 48h, excepto para muestras de agua que deberán incubarse a 44.5 °C ± 0.2°C durante 24h a

48h.

H.7.1.4 Agua de mar para el cultivo de moluscos bivalvos. Agitar la muestra vigorosamente veinticinco

veces en un arco de 30cm por 7s. Para la prueba de coliformes fecales, inocular la muestra de agua de mar

directamente en cinco tubos conten iendo el Caldo A -1, por dilución en porciones de 10mL, 1mL y 0.1 mL en

Medio A-1.

Incubar por 3h a 35 °C ± 0.5ºC para un periodo de resucitación, pasado este tiempo de incubación colocar

los tubos en un baño de agua a 44.5°C ± 0.2ºC por 21h ± 2h.

La producción de gas y/o efervescencia manifestada por una agitación suave de los tubos de Caldo A -1

incubados dentro de las 24h, indica una reacción positiva a coliformes de origen fecal. Para calcular el

NMP/100mL consultar la Tabla correspondiente H.8.4.2 (TABLA 2).

H.7.1.5 Prueba complementaria.

H.7.1.5.1 Esta es una prueba optativa de calidad para todas las muestras de agua que tiene como objetivo

confirmar el 10% de los tubos positivos de coliformes totales en caldo verde brillante. Tomar una asada de

cada uno de los tubos positivos de caldo verde brillante y sembrar por estría cruzada en agar Mc Conkey.

Incubar a 35°C ± 0.5°C por 24h ± 2h. Observar las colonias típicas fermentadoras de color rosa intenso que

pueden estar rodeadas de un halo opaco de precipitación de las sales biliares.

H.7.1.5.2 Seleccionar 1 o más colonias aisladas con las características anteriores o lo más parecido a esta

descripción e inocular igual número de tubos de fermentación con caldo lauril triptosa y a tubos con agar

nutritivo inclinado. Incubar a 35°C ± 0.5°C examinar los tubos a las 24h y observar si hay formación de gas.

Anotar los resultados. Si la formación de gas no se observa, incubar 24h más y anotar los resultados.

H.7.1.5.3 Realizar tinción de Gram a partir del crecimiento e n el agar nutritivo para observación de la

morfología microscópica de las colonias.

H.7.1.5.4 La formación de gas en los tubos de caldo lauril sulfato dentro de las 48h ± 3h y la observación

de bacterias Gram negativas, en forma de bacilos no esporulados c onstituyen una prueba positiva a la

presencia del grupo coliforme.

H.7.1.6 Prueba confirmativa para E. coli (por identificación bioquímica).

H.7.1.6.1 Prueba presuntiva.

H.7.1.6.1.1 Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y/o Caldo A -1 y sembrar por

estría cruzada en agar EMB-L para su aislamiento. Incubar las placas invertidas a 35 °C ± 1°C por 18°C - 24h.

Seleccionar 2 colonias de cada placa con la morfología colonial típica: colonias con centro negro, planas con o

sin brillo metálico y sembrarlas en agar cuenta estándar (placa o agar inclinado), para realizar las pruebas de

morfología microscópica y pruebas bioquímicas. Incubar las placas o tubos a 35°C ± 1°C por 18h -a 24h.

H.7.1.6.1.2 Si no hay colonias con morfología típica, proba r 1 o más colonias lo más parecido a E. coli de

cada placa. Realizar un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos cortos Gram

negativos.

H.7.1.6.1.3 Pruebas bioquímicas: Indol, Rojo de metilo, VP, citrato.

H.7.1.6.1.3.1 Producción de indol. Inocular un tubo con caldo triptona e incubarlo a 35 °C ± 0.5°C por 24h ±

2h. Adicionar 0.2mL a 0.3mL de reactivo de Kovac, dejando caer las gotas del reactivo por las paredes del

tubo y no agitar los tubos para observación del anillo rojo en la superficie. La presencia de una coloración roja

en la superficie del tubo se considera una prueba positiva.

H.7.1.6.1.3.2 VP. Inocular un tubo con caldo MR-VP e incubar a 35°C ± 0.5°C por 48h ± 2h. Transferir 1mL

a un tubo de 13mm x 100mm. Adicionar 0.6mL de solución α -naftol y 0.2mL de KOH al 40% y agitar. Cuando

se desarrolla un color de rosa a rojo en 15min a 30min, se considera una prueba positiva.

H.7.1.6.1.3.3 Rojo de metilo. A la otra parte del caldo MR -VP inocular adicionar cinco gotas de so lución

de rojo de metilo. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color amarillo

definido es una prueba negativa.

H.7.1.6.1.3.4 Citrato. Sembrar con inóculo ligero un tubo con caldo citrato de Koser, evitar turbiedad en el

tubo. Incubar a 35°C ± 0.5°C por 96h. Una reacción positiva se observa mediante el desarrollo de turbiedad

detectable. Se puede utilizar como alternativa citrato de Simmon el cual se debe inocular por estría. Incubar

35°C ± 0.5°C por 48h. Una prueba positiva se observa mediante crecimiento y/o cambio a una coloración azul;

la ausencia de crecimiento se considera una prueba negativa.

H.7.1.6.1.4 Interpretación de resultados de las pruebas bioquímicas.

H.7.1.6.1.4.1 Todos los cultivos que fermenten la lactosa con producción de gas dentro de las 48h a 35°C,

sean bacilos o bacilos cortos Gram negativos no esporulados y se obtengan las siguientes combinaciones

para el IMViC:

Pruebas Biotipo 1* Biotipo 2*

Indol + -

RM + +

VP - -

Citrato - -

* Son consideradas como E. coli.

H.7.1.6.1.4.2 Calcular el NMP de E. coli basada en la proporción de los tubos positivos de caldo EC

confirmados. Consultar el punto H.8 Cálculos.

H.7.2 Prueba para detectar E. coli en alimentos refrigerados o congelados.

H.7.2.1 Prueba Presuntiva. Seguir lo indicado en el punto H.7.3. Utilizando caldo lauril con MUG en vez de

caldo lauril. Inocular un tubo con una cepa de E. coli GUD positiva como control (ATCC 25922). Además

inocular otro tubo con una cepa de Enterobacter aerogenes (ATCC13048) como control negativo, para facilitar

la diferenciación entre los tubos que presenten s ólo crecimiento y crecimiento con fluorescencia. Inocular los

tubos por 24h a 48h ± 2h a 35°C. Examinar cada tubo con crecimiento (turbiedad y gas), después, observar

los tubos en la oscuridad con una lámpara de luz UV. Una prueba positiva para E. coli es la presencia de

fluorescencia en el tubo. La lectura a las 24h de incubación, identifica a E. coli en un 83%-95%, mientras que

a las 48h de incubación la identifica en un 96%-100%.

H.7.2.2 Prueba confirmativa. Confirmar todos los tubos positivos estriando en una placa de agar L -EMB,

incubar a 35°C ± 1°C por 24h y continuar como se indica en el punto H.7.1.6.1.1.

H.7.2.2.1 Prueba confirmativa para E. coli (por identific ación bioquímica). Calcular el NMP de E. coli

basada en la confirmación de tubos en las tres diluciones consecutivas.

H.7.3 Procedimiento para Alimentos.

H.7.3.1 Prueba Presuntiva. Pesar 25g del alimento en 225mL de regulador de fosfatos o diluyente de

peptona y moler por 2 min en vaso de licuadora u homogeneizador peristáltico, el volumen total en el vaso

debe cubrir totalmente las aspas. Las muestras congeladas deben mantenerse en refrigeración (2°C -5°C) un

máximo de 18h antes de su análisis, sin llegar a la descongelación. En caso de que la cantidad de muestra

disponible sea menor a 25g y el análisis necesite ser efectuado (por denuncia o queja ante la autoridad),

utilizar una cantidad de muestra que represente una proporción 1:10.

H.7.3.2 Preparar diluciones decimales con regulador de fosfatos. La cantidad de diluciones dependerá de

la densidad de coliformes esperada. Agitar las diluciones veinticinco veces en un arco de 30cm por 7s

transferir volúmenes de 1mL a tres tubos con 10mL de caldo lauril triptosa, por cada dilución por lo menos tres

diluciones consecutivas (el volumen que se transfiera nunca debe ser menor del 10% de la capacidad total de

la pipeta). Mantener la pipeta en ángulo de tal manera que descanse sobre el borde del tubo. El tiempo entre

la homogeneización de la muestra y la inoculación de los tubos no debe exceder de 15 min a 20 min.

H.7.3.3 Utilizar como medio de enriquecimiento caldo lauril triptosa, una vez inoculados incubar a 35°C ±

0.5°C. Examinar los tubos a las 24h y observar si h ay formación de gas. Anotar los resultados. Si la formación

de gas no se observa, incubar 24h más y anotar los resultados.

H.7.3.4 Prueba Confirmativa. Continuar como se indica en el H.7.1.2. Prueba Confirmatoria, considerando

que si la formación de gas no se observa, continuar la incubación 24h más.

H.8. CALCULOS.

H.8.1 Con frecuencia es necesario calcular el NMP con cantidades de muestra diferentes de los enlistados

en las Tablas H.8.4 desde el primer número de la combinación encontrada. Si la cantidad de muestra >0.01g

multiplicar el NMP enlistado en la tabla utilizada dependiendo del procedimiento realizado por 10.

H.8.2 Una determinación de cinco tubos que dé tres tubos positivos en 0.01g; dos tubos positivos en

0.001g y un tubo positivo en 0.0001g (3 -2-1) el resultado obtenido al leer en la Tabla H.8.4.2 (TABLA 2), es

17, multiplicar por 10 para así obtener 170 como el NMP final por g de muestra. De igual forma si la cantidad

más grande utilizada para la tabla de referencia es 1g en lugar de 0.1g, divid ir el NMP derivado de la Tabla

entre 10. Por ejemplo el resultado de la determinación del NMP en tres tubos para E. coli que dé tres tubos

positivos en 1g; un tubo positivo en 0.1g y ningún positivo en 0.01g (3 -1- 0) el resultado obtenido al leer en la

tabla H.8.4.1 (TABLA 1) es 43 y dividir entre 10, lo que da 4.3 como el NMP presuntivo por g de muestra.

H.8.3 Un método alternativo para obtener el NMP es usando la siguiente fórmula:

(NMP/g de la tabla - 100) X factor de dilución del tubo de en medio = NMP/g.

Para calcular el NMP/100 g multiplicar por 100.

H.8.4 Tablas.

H.8.4.1 Tabla 1. NMP para 1g de muestra cuando se usan tres tubos con porciones de 0.1; 0.01 y

0.001g.

Tubos Positivos Tubos Positivos Tubos Positivos Tubos Positivos

0,1 0,01 0,001 NMP 0,1 0,01 0,001 NMP 0,1 0,01 0,001 NMP 0,1 0,01 0,001 NMP

0 0 0 < 3 1 0 0 3,6 2 0 0 9,1 3 0 0 23

0 0 1 3 1 0 1 7,2 2 0 1 14 3 0 1 39

0 0 2 6 1 0 2 11 2 0 2 20 3 0 2 64

0 0 3 9 1 0 3 15 2 0 3 26 3 0 3 95

0 1 0 3 1 1 0 7,3 2 1 0 15 3 1 0 43

0 1 1 6,1 1 1 1 11 2 1 1 20 3 1 1 75

0 1 2 9,2 1 1 2 15 2 1 2 27 3 1 2 120

0 1 3 12 1 1 3 19 2 1 3 34 3 1 3 160

0 2 0 6,2 1 2 0 11 2 2 0 21 3 2 0 93

0 2 1 9,3 1 2 1 15 2 2 1 28 3 2 1 150

0 2 2 12 1 2 2 20 2 2 2 35 3 2 2 210

0 2 3 16 1 2 3 24 2 2 3 42 3 2 3 290

0 3 0 9,4 1 3 0 16 2 3 0 29 3 3 0 240

0 3 1 13 1 3 1 20 2 3 1 36 3 3 1 460

0 3 2 16 1 3 2 24 2 3 2 44 3 3 2 1100

0 3 3 19 1 3 3 29 2 3 3 53 3 3 3 >1100

Referencia: Official Methods of Analysis of AOAC International, 18 ed. 2005. Chapter 17.3, pag. 5

H.8.4.2 Tabla 2. NMP para 100mL de muestra cuando se usan 5 porciones en cada una de tres diluciones con series geométricas.

No. de Tubos positivos No. de Tubos positivos No. de Tubos positivos No. de Tubos positivos No. de Tubos positivos No. de Tubos positivos

10 mL 1 mL 0.1 mL NMP 10 mL 1 mL 0.1 mL NMP 10 mL 1 mL 0.1 mL NMP 10 mL 1 mL 0.1 mL NMP 10 mL 1 mL 0.1 mL NMP 10 mL 1 mL 0.1 mL NMP

0 0 0 <1.8 1 0 0 2.0 2 0 0 4.5 3 0 0 7.8 4 0 0 13 5 0 0 23

0 0 1 1.8 1 0 1 4.0 2 0 1 6.8 3 0 1 11 4 0 1 17 5 0 1 31

0 0 2 3.6 1 0 2 6.0 2 0 2 9.1 3 0 2 13 4 0 2 21 5 0 2 43

0 0 3 5.4 1 0 3 8.0 2 0 3 12 3 0 3 16 4 0 3 25 5 0 3 58

0 0 4 7.2 1 0 4 10 2 0 4 14 3 0 4 20 4 0 4 30 5 0 4 76

0 0 5 9.0 1 0 5 12 2 0 5 16 3 0 5 23 4 0 5 36 5 0 5 95

0 1 0 1.8 1 1 0 4.0 2 1 0 6.8 3 1 0 11 4 1 0 17 5 1 0 33

0 1 1 3.6 1 1 1 6.1 2 1 1 9.2 3 1 1 14 4 1 1 21 5 1 1 46

0 1 2 5.5 1 1 2 8.1 2 1 2 12 3 1 2 17 4 1 2 26 5 1 2 63

0 1 3 7.3 1 1 3 10 2 1 3 14 3 1 3 20 4 1 3 31 5 1 3 84

0 1 4 9.1 1 1 4 12 2 1 4 17 3 1 4 23 4 1 4 36 5 1 4 110

0 1 5 11 1 1 5 14 2 1 5 19 3 1 5 27 4 1 5 42 5 1 5 130

0 2 0 3.7 1 2 0 6.1 2 2 0 9.3 3 2 0 14 4 2 0 22 5 2 0 49

0 2 1 5.5 1 2 1 8.2 2 2 1 12 3 2 1 17 4 2 1 26 5 2 1 70

0 2 2 7.4 1 2 2 10 2 2 2 14 3 2 2 20 4 2 2 32 5 2 2 94

0 2 3 9.2 1 2 3 12 2 2 3 17 3 2 3 24 4 2 3 38 5 2 3 120

0 2 4 11 1 2 4 15 2 2 4 19 3 2 4 27 4 2 4 44 5 2 4 150

0 2 5 13 1 2 5 17 2 2 5 22 3 2 5 31 4 2 5 50 5 2 5 180

0 3 0 5.6 1 3 0 8.3 2 3 0 12 3 3 0 17 4 3 0 27 5 3 0 79

0 3 1 7.4 1 3 1 10 2 3 1 14 3 3 1 21 4 3 1 33 5 3 1 110

0 3 2 9.3 1 3 2 13 2 3 2 17 3 3 2 24 4 3 2 39 5 3 2 140

0 3 3 11 1 3 3 15 2 3 3 20 3 3 3 28 4 3 3 45 5 3 3 180

0 3 4 13 1 3 4 17 2 3 4 22 3 3 4 31 4 3 4 52 5 3 4 210

0 3 5 15 1 3 5 19 2 3 5 25 3 3 5 35 4 3 5 59 5 3 5 250

0 4 0 7.5 1 4 0 11 2 4 0 15 3 4 0 21 4 4 0 34 5 4 0 130

0 4 1 9.4 1 4 1 13 2 4 1 17 3 4 1 24 4 4 1 40 5 4 1 170

0 4 2 11 1 4 2 15 2 4 2 20 3 4 2 28 4 4 2 47 5 4 2 220

0 4 3 13 1 4 3 17 2 4 3 23 3 4 3 32 4 4 3 54 5 4 3 280

0 4 4 15 1 4 4 19 2 4 4 25 3 4 4 36 4 4 4 62 5 4 4 350

0 4 5 17 1 4 5 22 2 4 5 28 3 4 5 40 4 4 5 69 5 4 5 430

0 5 0 9.4 1 5 0 13 2 5 0 17 3 5 0 25 4 5 0 41 5 5 0 240

0 5 1 11 1 5 1 15 2 5 1 20 3 5 1 29 4 5 1 48 5 5 1 350

0 5 2 13 1 5 2 17 2 5 2 23 3 5 2 32 4 5 2 56 5 5 2 540

0 5 3 15 1 5 3 19 2 5 3 26 3 5 3 37 4 5 3 64 5 5 3 920

0 5 4 17 1 5 4 22 2 5 4 29 3 5 4 41 4 5 4 72 5 5 4 1600

0 5 5 19 1 5 5 24 2 5 5 32 3 5 5 45 4 5 5 81 5 5 5 >1600

Referencia: Official Methods of Analysis of AOAC International, 18 ed. 2005. Chapter 17.3.

H.8.4.3 Tabla 3. NMP 100mL de muestra de agua o hielo e intervalos de confianza del 95% utilizando

cinco tubos con 20 mL de muestra.

Tubos positivo NMP/100mL 95% de Limite de confianza (aproximado)

Inferior Superior

0 <1.1 0 3.0

1 1.1 0.05 6.3

2 2.6 0.3 9.6

3 4.6 0.8 14.7

4 8.0 1.7 26.4

5 >8.0 4.0 -

Referencia: American Public Heath Association. Standard Methods for the examination of Water and

Wastewater. 20th edition 1998. Washington DC.

H.8.4.4 Tabla 4. NMP por g de muestra e intervalos de confianza del 95%, utilizando diez tubos con

10mL de muestra.

Tubos

positivos NMP/100mL Límite de confianza

Interior Superior

0 <1.1 - 3.3

1 1.1 0.05 5.9

2 2.2 0.37 8.1

3 3.6 0.91 9.7

4 5.1 1.6 13

5 9 2.5 15

6 9.2 3.3 19

7 12 4.8 24

8 16 5.9 33

9 23 8.1 53

10 >23 12 -

Referencia: Americana Public Health Association. Standard Methods for the Examination of Water and

Wastewater. 20th edition 1998. Washington DC.

H.8.4.5 Tabla 5. NMP por g de muestra e intervalos de confianza del 95%, utilizando tres tubos con

0.1g, 0.01g y 0.001g de muestra.

NMP por g de muestra e intervalos de confianza del 95%, utilizando tres tubos con 0.1g, 0.01g y 0.001g de

muestra.

Tubos positivos NMP/g Límite de confianza Tubos positivos NMP/g Límite de confianza

0.10 0.01 0.001 Inferior Superior 0.10 0.01 0.001 Inferior Superior

0 0 0 <3.0 – 9.5 2 2 0 21 4.5 42

0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94

0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94

0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94

0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94

0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94

1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110

1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180

1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180

1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200

1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420

1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420

1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420

1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420

2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430

2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000

2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000

2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000

2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100

2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 –

Referencia: Bacteriological Analytical Manual. FDA, 8th Edición, Revisión A, 1998 Actualización Diciembre 2003.

H.8.4.6 Tabla 6. NMP por g de muestra e intervalos de confianza del 95%, utilizando cinco tubos con

0.1g, 0.01g y 0.001 g de muestra.

NMP por g de muestra e intervalos de confianza del 95%, utilizando cinco tubos con 0.1g, 0.01g y

0.001 g de muestra.

Tubos positivos NMP/

g

Límites de confianza Tubos positivos NMP/g Límites de

confianza

0.1 0.01 0.001 Inferior Superior 0.1 0.01 0.001 Inferior Superio

r

0 0 0 <.90 – 3.1 8 2 0 17 7.7 34

0 0 1 0.9 0.04 3.1 8 2 1 19 9 34

0 0 2 1.8 0.33 5.1 8 2 2 21 10 39

0 1 0 0.9 0.04 3.6 8 2 3 23 11 44

0 1 1 1.8 0.33 5.1 8 3 0 19 9 34

0 2 0 1.8 0.33 5.1 8 3 1 21 10 39

0 2 1 2.7 0.8 7.2 8 3 2 24 11 44

0 3 0 2.7 0.8 7.2 8 3 3 26 12 50

1 0 0 0.94 0.05 5.1 8 4 0 22 10 39

1 0 1 1.9 0.33 5.1 8 4 1 24 11 44

1 0 2 2.8 0.8 7.2 8 4 2 26 12 50

1 1 0 1.9 0.33 5.7 8 4 3 29 14 58

1 1 1 2.9 0.8 7.2 8 5 0 24 11 44

1 1 2 3.8 1.4 9 8 5 1 27 12 50

1 2 0 2.9 0.8 7.2 8 5 2 29 14 58

1 2 1 3.8 1.4 9 8 5 3 32 15 62

1 3 0 3.8 1.4 9 8 6 0 27 12 50

1 3 1 4.8 2.1 11 8 6 1 30 14 58

1 4 0 4.8 2.1 11 8 6 2 33 15 62

2 0 0 2 0.37 7.2 8 7 0 30 14 58

2 0 1 3 0.81 7.3 8 7 1 33 17 73

2 0 2 4 1.4 9 8 7 2 36 17 74

2 1 0 3 0.82 7.8 8 8 0 34 17 73

2 1 1 4 1.4 9 8 8 1 37 17 74

2 1 2 5 2.1 11 9 0 0 17 7.5 31

2 2 0 4 1.4 9.1 9 0 1 19 9 34

2 2 1 5 2.1 11 9 0 2 22 10 39

2 2 2 6.1 3 14 9 0 3 24 11 44

2 3 0 5.1 2.1 11 9 1 0 19 9 39

2 3 1 6.1 3 14 9 1 1 22 10 40

2 4 0 6.1 3 14 9 1 2 25 11 44

2 4 1 7.2 3.1 15 9 1 3 28 14 58

2 5 0 7.2 3.1 15 9 1 4 31 14 58

3 0 0 3.2 0.9 9 9 2 0 22 10 44

3 0 1 4.2 1.4 9.1 9 2 1 25 11 46

3 0 2 5.3 2.1 11 9 2 2 28 14 58

3 1 0 4.2 1.4 10 9 2 3 32 14 58

3 1 1 5.3 2.1 11 9 2 4 35 17 73

3 1 2 6.4 3 14 9 3 0 25 12 50

3 2 0 5.3 2.1 12 9 3 1 29 14 58

3 2 1 6.4 3 14 9 3 2 32 15 62

3 2 2 7.5 3.1 15 9 3 3 36 17 74

3 3 0 6.5 3 14 9 3 4 40 20 91

3 3 1 7.6 3.1 15 9 4 0 29 14 58

3 3 2 8.7 3.6 17 9 4 1 33 15 62

3 4 0 7.6 3.1 15 9 4 2 37 17 74

3 4 1 8.7 3.6 17 9 4 3 41 20 91

3 5 0 8.8 3.6 17 9 4 4 45 20 91

4 0 0 4.5 1.6 11 9 5 0 33 17 73

NMP por g de muestra e intervalos de confianza del 95%, utilizando cinco tubos con 0.1g, 0.01g y

0.001 g de muestra.

Tubos positivos NMP/

g

Límites de confianza Tubos positivos NMP/g Límites de

confianza

0.1 0.01 0.001 Inferior Superior 0.1 0.01 0.001 Inferior Superio

r

4 0 1 5.6 2.2 12 9 5 1 37 17 74

4 0 2 6.8 3 14 9 5 2 42 20 91

4 1 0 5.6 2.2 12 9 5 3 46 20 91

4 1 1 6.8 3 14 9 5 4 51 25 120

4 1 2 8 3.6 17 9 6 0 38 17 74

4 2 0 6.8 3 15 9 6 1 43 20 91

4 2 1 8 3.6 17 9 6 2 47 21 100

4 2 2 9.2 3.7 17 9 6 3 53 25 120

4 3 0 8.1 3.6 17 9 7 0 44 20 91

4 3 1 9.3 4.5 18 9 7 1 49 21 100

4 3 2 10 5 20 9 7 2 54 25 120

4 4 0 9.3 4.5 18 9 7 3 60 26 120

4 4 1 11 5 20 9 8 0 50 25 120

4 5 0 11 5 20 9 8 1 55 25 120

4 5 1 12 5.6 22 9 8 2 61 26 120

4 6 0 12 5.6 22 9 8 3 68 30 140

5 0 0 6 2.5 14 9 9 0 57 25 120

5 0 1 7.2 3.1 15 9 9 1 63 30 140

5 0 2 8.5 3.6 17 9 9 2 70 30 140

5 0 3 9.8 4.5 18 10 0 0 23 11 44

5 1 0 7.3 3.1 15 10 0 1 27 12 50

5 1 1 8.5 3.6 17 10 0 2 31 14 58

5 1 2 9.8 4.5 18 10 0 3 37 17 73

5 1 3 11 5 21 10 1 0 27 12 57

5 2 0 8.6 3.6 17 10 1 1 32 14 61

5 2 1 9.9 4.5 18 10 1 2 38 17 74

5 2 2 11 5 21 10 1 3 44 20 91

5 3 0 10 4.5 18 10 1 4 52 25 120

5 3 1 11 5 21 10 2 0 33 15 73

5 3 2 13 5.6 23 10 2 1 39 17 79

5 4 0 11 5 21 10 2 2 46 20 91

5 4 1 13 5.6 23 10 2 3 54 25 120

5 4 2 14 7 26 10 2 4 63 30 140

5 5 0 13 6.3 25 10 3 0 40 17 91

5 5 1 14 7 26 10 3 1 47 20 100

5 6 0 14 7 26 10 3 2 56 25 120

6 0 0 7.8 3.1 17 10 3 3 66 30 140

6 0 1 9.2 3.6 17 10 3 4 77 34 150

6 0 2 11 5 20 10 3 5 89 39 180

6 0 3 12 5.6 22 10 4 0 49 21 120

6 1 0 9.2 3.7 18 10 4 1 59 25 120

6 1 1 11 5 21 10 4 2 70 30 150

6 1 2 12 5.6 22 10 4 3 82 38 180

6 1 3 14 7 26 10 4 4 94 44 180

6 2 0 11 5 21 10 4 5 110 50 210

6 2 1 12 5.6 22 10 5 0 62 26 140

6 2 2 14 7 26 10 5 1 74 30 150

6 2 3 15 7.4 30 10 5 2 87 38 180

6 3 0 12 5.6 23 10 5 3 100 44 180

NMP por g de muestra e intervalos de confianza del 95%, utilizando cinco tubos con 0.1g, 0.01g y

0.001 g de muestra.

Tubos positivos NMP/

g

Límites de confianza Tubos positivos NMP/g Límites de

confianza

0.1 0.01 0.001 Inferior Superior 0.1 0.01 0.001 Inferior Superio

r

6 3 1 14 7 26 10 5 4 110 50 210

6 3 2 15 7.4 30 10 5 5 130 57 220

6 4 0 14 7 26 10 5 6 140 70 280

6 4 1 15 7.4 30 10 6 0 79 34 180

6 4 2 17 9 34 10 6 1 94 39 180

6 5 0 16 7.4 30 10 6 2 110 50 210

6 5 1 17 9 34 10 6 3 120 57 220

6 5 2 19 9 34 10 6 4 140 70 280

6 6 0 17 9 34 10 6 5 160 74 280

6 6 1 19 9 34 10 6 6 180 91 350

6 7 0 19 9 34 10 7 0 100 44 210

7 0 0 10 4.5 20 10 7 1 120 50 220

7 0 1 12 5 21 10 7 2 140 61 280

7 0 2 13 6.3 25 10 7 3 150 73 280

7 0 3 15 7.2 28 10 7 4 170 91 350

7 1 0 12 5 22 10 7 5 190 91 350

7 1 1 13 6.3 25 10 7 6 220 100 380

7 1 2 15 7.2 28 10 7 7 240 110 480

7 1 3 17 7.7 31 10 8 0 130 60 250

7 2 0 13 6.4 26 10 8 1 150 70 280

7 2 1 15 7.2 28 10 8 2 170 80 350

7 2 2 17 7.7 31 10 8 3 200 90 350

7 2 3 19 9 34 10 8 4 220 100 380

7 3 0 15 7.2 30 10 8 5 250 120 480

7 3 1 17 9 34 10 8 6 280 120 480

7 3 2 19 9 34 10 8 7 310 150 620

7 3 3 21 10 39 10 8 8 350 150 620

7 4 0 17 9 34 10 9 0 170 74 310

7 4 1 19 9 34 10 9 1 200 91 380

7 4 2 21 10 39 10 9 2 230 100 480

7 4 3 23 11 44 10 9 3 260 120 480

7 5 0 19 9 34 10 9 4 300 140 620

7 5 1 21 10 39 10 9 5 350 150 630

7 5 2 23 11 44 10 9 6 400 180 820

7 6 0 21 10 39 10 9 7 460 210 970

7 6 1 23 11 44 10 9 8 530 210 970

7 6 2 25 12 46 10 9 9 610 280 1300

7 7 0 23 11 44 10 10 0 240 110 480

7 7 1 26 12 50 10 10 1 290 120 620

8 0 0 13 5.6 25 10 10 2 350 150 820

8 0 1 15 7 26 10 10 3 430 180 970

8 0 2 17 7.5 30 10 10 4 540 210 1300

8 0 3 19 9 34 10 10 5 700 280 1500

8 1 0 15 7.1 28 10 10 6 920 350 1900

8 1 1 17 7.7 31 10 10 7 1200 480 2400

8 1 2 19 9 34 10 10 8 1600 620 3400

8 1 3 21 10 39 10 10 9 2300 810 5300

10 10 10 >2300 1300 –

H.8.4.7 Tabla 7. NMP por g de muestra e intervalos de confianza del 95%, utilizando diez tubos con

0.1g, 0.01g y 0.001g de muestra.

NMP por gramo de muestra e intervalos de confianza del 95%, utilizando 10 tubos con 0.1; 0.01 y 0.001 g de muestra

Tubos positivos NMP/g Límite de confianza Tubos positivos NMP/g Límite de confianza

0.1 0.01 0.001 Inferior Superior 0.1 0.01 0.001 Inferior Superior

3 4 0 7.6 3.1 15 9 4 2 37 17 74

3 4 1 8.7 3.6 17 9 4 3 41 20 91

3 5 0 8.8 3.6 17 9 4 4 45 20 91

4 0 0 4.5 1.6 11 9 5 0 33 17 73

4 0 1 5.6 2.2 12 9 5 1 37 17 74

4 0 2 6.8 3 14 9 5 2 42 20 91

4 1 0 5.6 2.2 12 9 5 3 46 20 91

4 1 1 6.8 3 14 9 5 4 51 25 120

4 1 2 8 3.6 17 9 6 0 38 17 74

4 2 0 6.8 3 15 9 6 1 43 20 91

4 2 1 8 3.6 17 9 6 2 47 21 100

4 2 2 9.2 3.7 17 9 6 3 53 25 120

4 3 0 8.1 3.6 17 9 7 0 44 20 91

4 3 1 9.3 4.5 18 9 7 1 49 21 100

4 3 2 10 5 20 9 7 2 54 25 120

4 4 0 9.3 4.5 18 9 7 3 60 26 120

4 4 1 11 5 20 9 8 0 50 25 120

4 5 0 11 5 20 9 8 1 55 25 120

4 5 1 12 5.6 22 9 8 2 61 26 120

4 6 0 12 5.6 22 9 8 3 68 30 140

5 0 0 6 2.5 14 9 9 0 57 25 120

5 0 1 7.2 3.1 15 9 9 1 63 30 140

5 0 2 8.5 3.6 17 9 9 2 70 30 140

5 0 3 9.8 4.5 18 10 0 0 23 11 44

5 1 0 7.3 3.1 15 10 0 1 27 12 50

5 1 1 8.5 3.6 17 10 0 2 31 14 58

5 1 2 9.8 4.5 18 10 0 3 37 17 73

5 1 3 11 5 21 10 1 0 27 12 57

5 2 0 8.6 3.6 17 10 1 1 32 14 61

5 2 1 9.9 4.5 18 10 1 2 38 17 74

5 5 5 11 5 21 10 1 3 44 20 91

5 3 0 10 4.5 18 10 1 4 52 25 120

5 3 1 11 5 21 10 2 0 33 15 73

5 3 2 13 5.6 23 10 2 1 39 17 79

5 4 0 11 5 21 10 2 2 46 20 91

5 4 1 13 5.6 23 10 2 3 54 25 120

5 4 2 14 7 26 10 2 4 63 30 140

5 5 0 13 6.3 25 10 3 0 40 17 91

5 5 1 14 7 26 10 3 1 47 20 100

5 6 0 14 7 26 10 3 2 56 25 120

6 0 0 7.8 3.1 17 10 3 3 66 30 140

6 0 1 9.2 3.6 17 10 3 4 77 34 150

6 0 2 11 5 20 10 3 5 89 39 180

6 0 3 12 5.6 22 10 4 0 49 21 120

6 1 0 9.2 3.7 18 10 4 1 59 25 120

6 1 1 11 5 21 10 4 2 70 30 150

6 1 2 12 5.6 22 10 4 3 82 38 180

6 1 3 14 7 26 10 4 4 94 44 180

6 2 0 11 5 21 10 4 5 110 50 210

6 2 1 12 5.6 22 10 5 0 62 26 140

NMP por gramo de muestra e intervalos de confianza del 95%, utilizando 10 tubos con 0.1; 0.01 y 0.001 g de muestra

Tubos positivos NMP/g Límite de confianza Tubos positivos NMP/g Límite de confianza

0.1 0.01 0.001 Inferior Superior 0.1 0.01 0.001 Inferior Superior

6 2 2 14 7 26 10 5 1 74 30 150

6 2 3 15 7.4 30 10 5 2 87 38 180

6 3 0 12 5.6 23 10 5 3 100 44 180

6 3 1 14 7 26 10 5 4 110 50 210

6 3 2 15 7.4 30 10 5 5 130 57 220

6 4 0 14 7 26 10 5 6 140 70 280

6 4 1 15 7.4 30 10 6 0 79 34 180

6 4 2 17 9 34 10 6 1 94 39 180

6 5 0 16 7.4 30 10 6 2 110 50 210

6 5 1 17 9 34 10 6 3 120 57 220

6 5 2 19 9 34 10 6 4 140 70 280

6 6 0 17 9 34 10 6 5 160 74 280

6 6 1 19 9 34 10 6 6 180 91 350

6 7 0 19 9 34 10 7 0 100 44 210

7 0 0 10 4.5 20 10 7 1 120 50 220

7 0 1 12 5 21 10 7 2 140 61 280

7 0 2 13 6.3 25 10 7 3 150 73 280

7 0 3 15 7.2 28 10 7 4 170 91 350

7 1 0 12 5 22 10 7 5 190 91 350

7 1 1 13 6.3 25 10 7 6 220 100 380

7 1 2 15 7.2 28 10 7 7 240 110 480

7 1 3 17 7.7 31 10 8 0 130 60 250

7 2 0 13 6.4 26 10 8 1 150 70 280

7 2 1 15 7.2 28 10 8 2 170 80 350

7 2 1 17 7.7 31 10 8 3 200 90 350

7 2 3 19 9 34 10 8 4 220 100 380

7 3 0 15 7.2 30 10 8 5 250 120 480

7 3 1 17 9 34 10 8 6 280 120 480

7 3 2 19 9 34 10 8 7 310 150 620

7 3 3 21 10 39 10 8 8 350 150 620

7 4 0 17 9 34 10 9 0 170 74 310

7 4 1 19 9 34 10 9 1 200 91 380

7 4 2 21 10 39 10 9 2 230 100 480

7 4 3 23 11 44 10 9 3 260 120 480

7 5 0 19 9 34 10 9 4 300 140 620

7 5 1 21 10 39 10 9 5 350 150 630

7 5 2 23 11 44 10 9 6 400 180 820

7 6 0 21 10 39 10 9 7 460 210 970

7 6 1 23 11 44 10 9 8 530 210 970

7 6 2 25 12 46 10 9 9 610 280 1300

7 7 0 23 11 44 10 10 0 240 110 480

7 7 1 26 12 50 10 10 1 290 120 620

8 0 0 13 5.6 25 10 10 2 350 150 820

8 0 1 15 7 26 10 10 3 430 180 970

8 0 2 17 7.5 30 10 10 4 540 210 1300

8 0 3 19 9 34 10 10 5 700 280 1500

8 1 0 15 7.1 28 10 10 6 920 350 1900

8 1 1 17 7.1 31 10 10 7 1200 480 2400

8 1 2 19 9 34 10 10 8 1600 620 3400

8 1 3 21 10 39 10 10 9 2300 810 5300

10 10 10 >2300 1300 --

H.8.4.8 Tabla 8. NMP por 100mL de muestra inoculando tubos de cada una de tres diluciones

geométricas.

Tubos positivos

mL NMP

Tubos positivos

mL NMP

Tubos positivos

mL

Tubos positivos

mL NMP

10 1 0.1 10 1 0.1 10 1 0.1 NMP 10 1 0.1

0 0 0 <3 1 0 0 3.6 2 0 0 9.1 3 0 0 23

0 0 1 3 1 0 1 7.2 2 0 1 14 3 0 1 39

0 0 2 6 1 0 2 11 2 0 2 20 3 0 2 64

0 0 3 9 1 0 3 15 2 0 3 26 3 0 3 95

0 1 0 3 1 1 0 7.3 2 1 0 15 3 1 0 43

0 1 1 6.1 1 1 1 11 2 1 1 20 3 1 1 75

0 1 2 9.2 1 1 2 15 2 1 2 27 3 1 2 120

0 1 3 12 1 1 3 19 2 1 3 34 3 1 3 160

0 2 0 6.2 1 2 0 11 2 2 0 21 3 2 0 93

0 2 1 9.3 1 2 1 15 2 2 1 28 3 2 1 150

0 2 2 12 1 2 2 20 2 2 2 35 3 2 2 210

0 2 3 16 1 2 3 24 2 2 3 42 3 2 3 290

0 3 0 9.4 1 3 0 16 2 3 0 29 3 3 0 240

0 3 1 13 1 3 1 20 2 3 1 36 3 3 1 460

0 3 2 16 1 3 2 24 2 3 2 44 3 3 2 1100

0 3 3 19 1 3 3 29 2 3 3 53 3 3 3 >1100

Referencia: Recommended Procedures for the Examination of Sea Water and Shellfish. Fourth Edition

1970. APHA. New York

H.8.5 ESTIMACIÓN DE LA DENSIDAD MICROBIANA POR LA TÉCNICA DE NMP. Uso de Tablas de

NMP con 95% de límite de confianza.

H.8.5.1 Las Tablas H.8.4.5 (Tabla 5), H.8.4.6 (Tabla 6), H.8.4.7 (Tabla 7) presentan la estimación

estadística de los valores del NMP que corresponden al 95% de límite de confianza cuando se utilizan tres,

cinco y diez tubos. Otras combinaciones de resultados positivos y negativos no encontrados en estas Tablas,

tienen muy baja probabilidad de que se presenten. Si los resultados no están incluidos en las Tablas, se

deberá repetir la prueba a partir de la muestra original. Si no es posible, el NMP se puede obtener aplicando

una ecuación (véase H.9 y el 95% de Límite de Confianza) para tener el NMP aproximado (para las

combinaciones de tres y cinco tubos).

H.8.5.2 El intervalo del 95% de confianza se interpreta como sigue: si el a nalista supone que el número

real de microorganismos cae dentro de los límites, entonces se asume que será correcto el 95% de las veces.

El valor del NMP tabulado representa un intervalo y no un valor absoluto.

H.8.5.3 Cuando se preparan más de tres diluci ones de una muestra, el NMP deberá determinarse a partir

de los resultados de tres diluciones consecutivas. Primero, para todas las diluciones que tengan todos los

tubos positivos, seleccionar la dilución mayor. Después usar las dos siguientes diluciones m ayores. Cuando

en ninguna de las diluciones probadas hubiera crecimiento en todos los tubos, seleccionar (si es posible) las

primeras tres diluciones consecutivas para que la dilución media contenga resultados positivos. Cuando se

presenta un resultado positivo en la dilución más alta no seleccionada (menor cantidad de muestra), sumar el

número de tubos positivos a la dilución más alta seleccionada. Cuando todos los tubos de todas las diluciones

son positivos seleccionar las tres diluciones más altas.

H.8.5.3.1 Ejemplo para determinar el NMP estimado en series de 3 tubos con 1g (mL) de muestra por

tubo.

Ejemplo

Cantidad de muestra (g o mL)a Valores positivos

reportados

NMP estimado/g o

mLb

0.1 0.01 0.001 0.0001 0.00001

A 3/3 3/3 2/3 0/3 0/3 3-2-0 930

B 3/3 3/3 3/3 2/3 0/3 3-2-0 9300

C 0/3 0/3 1/3 0/3 0/3 0-1-0 30

D 3/3 3/3 2/3 1/3 1/3 3-2-2 2100

E 3/3 3/3 3/3 3/3 3/3 3-3-3 >110000

a Numerador/denominador = número de tubos positivos/número de tubos inoculados

b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por 100 para expresarlos como NMP/100g (mL)

H.8.5.3.2 Ejemplo para determinar el NMP estimado en series de cinco tubos con 1g (mL) de muestra por

tubo.

Ejemplo

Cantidad de muestra (g o mL)a Valores positivos

reportados

NMP estimado/g o

mLb

0.1 0.01 0.001 0.0001 0.00001

A 5/5 5/5 2/5 0/5 0/5 5-2-0 490

B 5/5 5/5 5/5 2/5 0/5 5-2-0 4900

C 0/5 0/5 1/5 0/5 0/5 0-1-0 18

D 5/5 5/5 3/5 1/5 1/5 5-3-2 1400

E 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5-5-5 >160000

a Numerador/denominador = número de tubos positivos/número de tubos inoculados.

b Multiplicar todos los valores de NMP/g (mL) por 100 para expresarlos como NMP/100 g (mL).

H.9 CÁLCULO APROXIMADO DEL NMP Y EL 95% DE LÍMITE DE CONFIANZA.

H.9.1 Debido a la inherente complejidad para calcular los límites de confianza del NMP lo más común es el

uso de Tablas. Generalmente estas Tablas están limitadas al uso de tres, cinco y diez tubos por dilución,

incluso usando un método aceptado, pueden presentarse datos irregulares o accidentes de laboratorio que

causan pérdida de un o o más tubos de dilución. En este caso una serie de diluciones de por ejemplo: 5, 4, 4

puede dar una lectura de 5 -2-0. Para estos casos se puede aplicar una fórmula sencilla, la cual no

corresponde exactamente con los resultados obtenidos teóricamente; si n embargo, las desviaciones

generalmente son pequeñas, esta fórmula no debe ser aplicada para fines de regulación. La fórmula no

restringe el número de tubos o las diluciones y puede aplicarse para todo tipo de pruebas. El cálculo

aproximado de Thomas está dado por la siguiente ecuación:

NMP/g = P/(N T)1/2

Donde: P es el número de tubos positivos, N es la cantidad total de muestra (g) en todos los tubos

negativos y T es la cantidad total de muestra (g) en todos los tubos.

Por ejemplo, considerando que se tuvieran serie de diluciones al doble:

MUESTRA (g) No. DE TUBOS No. DE TUBOS

POSITIVOS

8

4

2

1

0.5

0.25

5

5

5

5

5

5

5

4

2

0

1

0

El número de tubos positivos es:

P = (5 + 4 + 2+ 1) = 12;

N = (8x0) + (4x1) + (2x3) + (1x5) + (0.5x4) + (0.25x5) = 18, 25; y

T = 5 (8+4+2+1+0,5+0,25) = 78,75

NPM/g = 12/(18,25 x 78,75)1/2 = 0,32/g o 32/100 g.

Los límites de confianza del 95% estimados, pueden obtenerse del antilogaritmo de base 10 con la

siguiente ecuación:

log (NMP/g) ±1,078 [(log a)/n ]1/2

Log (NMP/g) ± (1,96) (0,55)

Donde: a es el radio de dilución 2 y

n es el número de tubos por dilución.

Para el ejemplo anterior el NMP con n = 5 y un límite de confianza aproximado de 95% será el siguiente:

log 0,32 ± (1,078)[(log a)/n ]1/2

= -0,495 ± 0,265

Entonces el límite i nferior es el antilogaritmo ( -0,76) = 0,17/g o 17/100 g y el límite superior es el

antilogaritmo (-0,23) = 0,59/g o 59/100 g. Cuando se compara con las Tablas el NMP podría ser 0,31/g con

límites de confianza de 0,16/g y 0,57/g.

H.10 INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS.

H.10.1 Expresar en NMP/g o mL para alimentos y NMP/100mL para agua.

H.10.2 Cuando se obtienen resultados negativos (ausencia de gas en los tubos), informar el límite de

detección que corresponde a menos del valor más bajo del NMP de la Tabla ut ilizada. Excepto en los casos

de agua para uso y consumo humano que como lo indica la Modificación a la Norma Oficial Mexicana NOM-

127-SSA1-1994, Salud Ambiental. Agua para uso y consumo humano. Límites permisibles de calidad y

tratamientos a que debe some terse el agua para su potabilización, debe expresarse como “No detectable” o

“ND”.

H.11 MEDIDAS DE CONTROL DE CALIDAD.

H.11.1 Verificar la funcionalidad del procedimiento analítico mediante cultivos control con cepas de E. coli

y E. aerogenes para coliformes fecales y E. coli y K. pneumoniae para la determinación de E. coli con caldo

EC-MUG.

H.11.2 Registrar las temperaturas de incubación con termómetros verificados.

H.11.3 Pesar la muestra en balanza calibrada y verificada.

H.11.4 Verificar el ciclo de est erilización de autoclaves con indicador biológico y termómetro de máximas

calibrado o verificado.

H.11.5 Verificar el ciclo de esterilización de hornos con indicador biológico.

H.11.6 Realizar control de medios de cultivo con cepas tipo (evaluación biológica) y evaluación física.

H.11.7 Realizar control ambiental por el método de sedimentación.

H.12 VALIDEZ DE LA PRUEBA.

H.12.1 Cuando todos los tubos de la menor dilución sean positivos y todos los tubos de la dilución mayor

sean negativos o la combinación de ambos.

H.12.2 Si el crecimiento de los controles no es característico, la prueba se invalida.

H.13 Diagrama de Flujo.

H.14 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.

H.14.1 Caldo A -1. El caldo A -1 debe prepararse a partir de sus ingredientes individuales. Las f órmulas

comerciales no son aceptables.

H.14.1.1 Fórmula.

Este medio se debe preparar a partir de los siguientes ingredientes:

Lactosa 5.0g

Triptona 20.0g

Cloruro de sodio 5.0g

Salicina 0.5g

Eter p-isoctilfenil polietilen glicol (Tritón X-100) 1.0mL

Agua destilada 1000mL

H.14.1.2 Preparación: Disolver los ingredientes en 1L de agua destilada hasta su disolución, calentar

suavemente sólo si es necesario, agregar 1mL del Tritón X -100 y ajustar el pH a 6.9 ± 0.1. Para alícuotas de

10mL de muestra preparar y ut ilizar el medio a doble concentración (2X). Para lograr aproximadamente el

mismo nivel del medio e inoculo en todos los tubos, distribuir porciones de 10mL del caldo en tubos de 18mm

x 150mm. Los tubos deben contener campanas de Durham; usar tubos de 22mm x 175mm para el caldo a

doble concentración (2X). Esterilizar en autoclave a 121ºC por 10min y guardar el medio a temperatura

ambiente en un lugar oscuro por no más de 7 días, para evitar la formación de precipitado o floculo.

H.14.2 Caldo lauril Triptosa.

H.14.2.1 Fórmula.

Bacto triptosa 20.0g

Bacto lactosa 5.0g

Fosfato potásico dibásico 2.75g

Fosfato potásico monobásico 2.75g

Cloruro de sodio 5.0g

Lauril sulfato de sodio 0.1g

Agua destilada 1000mL

pH final: 6,8 ± 0,2 a 25°C.

H.14.2.2 Preparación: Disolver los ingredientes en 1L de agua destilada, ajustar el pH si es necesario y

distribuir en tubos de ensaye 16mm x 150mm con campanas de Durham. Adicionar el volumen de medio de

acuerdo con la siguiente tabla cuando se prepare a partir de medio comp leto deshidratado. Esterilizar en

autoclave durante 15 min a 121ºC.

Preparación de caldo lauril triptosa.

Cantidad de

muestra inoculada

(mL)

Cantidad de medio por tubo (mL) Volumen de medio

más inóculo (mL)

Caldo lauril Triptosa

requerido g/l

1 10 o más 11 o más 35.6

10 10 20 71.2

10 20 30 53.4

20 10 30 106.8

100 50 150 106.8

100 35 135 137.1

100 20 120 213.6

H.14.3 Caldo EC.

H.14.3.1 Fórmula.

Bacto triptosa o tripticasa 20.0g

Bacto lactosa 5.0g

Bacto sales biliares No. 3 1.5g

Fosfato dipotásico 4.0g

Fosfato monopotásico 1.5g

Cloruro de sodio 5.0g

Agua destilada 1000mL

pH final: 6.9 ± 0.2 a 25°C.

H.14.3.2 Preparación: Disolver los ingredientes en 1L de agua destilada, dejar en reposo durante 5 min a

10 min, mezclar bien hasta que se disuelva por completo. Ajustar el pH si es necesario. Distribuir en porciones

de 10mL en tubos de ensaye de 16mm x 150mm con campanas de Durham y esterilizar en autoclave durante

15 min a 121°C.

H.14.4 EMB-L.

H.14.4.1 Fórmula.

Peptona 10.0g

Lactosa 10.0g

K2HPO4 2.0g

Eosina Y 0.4g

Azul de metileno 0.065g

Agar 15.0g

Agua destilada 1000mL

pH final: 7,1 ± 0,2

H.14.4.2 Preparación: Disolver la peptona, el fosfato y el agar en 1L de agua, calentar hasta ebullición

para la disolución completa, distribuir en po rciones de 100mL o 200mL y esterilizar a no más de 121°C por 15

min.

Fundir antes de su uso y adicionar a cada porción de 100mL lo siguiente:

a) 5mL de solución de lactosa al 20% estéril.

b) 2mL de solución acuosa de eosina y al 2%.

c) 4.3mL de solución acuosa de azul de metileno al 0.15%.

Cuando se use el producto deshidratado disolver todos los ingredientes de acuerdo con las instrucciones

del fabricante.

H.14.5 Caldo triptona al 1%.

H.14.5.1 Fórmula.

Triptona o tripticasa 10g

Agua destilada 1000mL

pH final: 6.9 ± 0.2

H.14.5.2 Preparación: Disolver los ingredientes, distribuir en porciones de 5mL en tubos de ensaye de

16mm x 125mm o 16mm x 150mm y esterilizar a 121°C por 15 min.

H.14.6 Caldo MR – VP.

H.14.6.1 Fórmula.

Peptona tamponada 7g

Glucosa 5g

K2HPO4 5g

Agua destilada 1000mL

pH final: 6.9 ± 0.2

o

Digerido Pancreático de caseína

Digerido péptico de tejido animal

3.5g

3.5g

Dextrosa 5g

Fosfato de potasio 5g

Agua destilada 1000mL

pH 6.9 ± 0.2

o

Peptona 5g

Glucosa 5g

Regulador de Fosfatos 5g

Agua destilada

pH 7.5 ± 0.2

1000mL

H.14.6.2 Preparación: Disolver los ingredientes con calentamiento suave si es necesario, distribuir en

volúmenes de 10mL en tubos de ensaye de 16mm x 150mm y esterilizar a 121°C por 15min.

H.14.7 Caldo Citrato de Koser.

H.14.7.1 Fórmula.

NaNH4HPO4 4H2O 1.5g

KH2PO4 (monobásico) 1.0g

MgSO4 7H2O 0.2g

Citrato de sódio 2H2O 3.0g

Agua destilada 1000mL

H.14.7.2 Preparación: Distribuir 5mL del caldo preferentemente en tubos de ensaye con tapa de rosca y

esterilizar a 121°C por 15 min.

Esta formulación se recomienda en los métodos de análisis oficial de AOAC y en los Métodos Estándares

para el Análisis de Agua y Aguas de Desecho (APHA). Éste difiere de la composición del medio deshidratado

disponible comercialmente y es recomendable su uso.

H.14.8 Citrato de Simmon.

H.14.8.1 Fórmula.

NaNH4HPO4•4H2O 1.0g a 1.5g

KH2PO4 (monobásico) 1.0g

MgSO4•7H2O 0.2g

Citrato de sódio 2H2O 2.0g a 3.0g

NaCl 5.0g

Agar 13g-15g

Azul de bromotimol 0.08g

Agua destilada 1000 mL

H.14.8.2 Preparación. Disolver los ingredientes y calentar a ebullición por 1 min. Distribuir en porciones de

5mL, en tubos con tapón de rosca, esterilizar por 15 min a 121ºC y dejar solidificar en una superficie lo

suficientemente inclinada para tener una profundidad de 3cm.

H.14.9 Regulador de fosfatos solución concentrada.

H.14.9.1 Fórmula.

KH2PO4 34g

Agua destilada 500mL

H.14.9.2 Preparación: Solución concentrada: Disolver el fosfato en 500mL de agua y ajustar el pH a 7.2 ±

0.2, con solución de hidróxido d e sodio 1.0N, llevar a 1L con agua y esterilizar durante 15 min a 121°C.

Conservar en refrigeración.

Solución de trabajo: Tomar 1.25mL de la solución concentrada y llevar a 1L con agua. Distribuir en

porciones de 99mL, 90mL y 9mL según se requiera. Esteril izar a 121°C durante 15 min. Después de la

esterilización, el pH y los volúmenes finales de la solución de trabajo deberán ser iguales a los iniciales.

H.14.10 Diluyente de peptona al 0.1%.

H.14.10.1 Fórmula.

Peptona 1g

Agua destilada 1000mL

pH: 7.0 ± 0.2

H.14.10.2 Preparación: Disolver la peptona en el agua destilada y esterilizar a 121°C por 15 min.

H.14.11 Reactivo de Kovac.

H.14.11.1 Fórmula.

p-dimetilaminobenzaldehído 5g

Alcohol amílico (normal) 75mL

HCI concentrado 25mL

H.14.11.2 Preparación: Disolver el p-Dimetilaminobenzaldehído en alcohol amílico normal, adicionar

lentamente el HCl. Almacenar a 4°C.

H.14.12 Reactivo de VP.

H.14.12.1 Fórmula.

Solución 1.

alfa-naftol 5g

Alcohol Absoluto 100mL

Solución 2.

KOH 40g

Agua destilada Para llevar a 100mL

H.14.12.2 Preparación: Disolver el alfa-naftol en 100mL del alcohol absoluto; para la solución 2, disolver

el KOH en 100mL de agua destilada.

H.14.13 Indicador rojo de metilo.

H.14.13.1 Fórmula.

Rojo de metilo 0.10g

Etanol al 95% 300mL

Agua destilada Para completar 500mL

H.14.13.2 Preparación: Disolver el rojo de metilo en 300mL de etanol y aforar a 500mL con agua

destilada.

H.14.14 Reactivos para la coloración de Gram.

H.14.14.1 Cristal Violeta.

H.14.14.1.1 Fórmula.

Solución A.

Cristal violeta (colorante 90%) 2g

Etanol 95% 20mL

Solución B.

Oxalato de amonio 0.8g

Agua destilada 80mL

H.14.14.1.2 Preparación: Disolver el cristal violeta en 20mL del alcohol al 95%; para la solución 2,

disolver el Oxalato de Amonio en 80mL de agua destilada. Me zclar la solución A y B y filtrar a través de un

papel filtro. Almacenar por 24h.

H.14.14.2 Lodo.

H.14.14.2.1 Fórmula.

Iodo 1g

Ioduro de potasio (KI) 2g

Agua Destilada 300mL

H.14.14.2.2 Preparación: Colocar el Kl en un mortero, adicionar el iodo, tritu rar con el pistilo por 5s a 10s,

adicionar 1mL de agua y triturar. Adicionar 5mL de agua y triturar. Adicionar 10mL de agua y triturar. Vaciar

esta solución en una botella de reactivo, enjuagar el mortero y el pistilo con la cantidad de agua necesaria

para completar 300mL.

H.14.14.3 Colorante de contraste (solución concentrada).

H.14.14.3.1 Fórmula.

Safranina 2.5g

Etanol al 95% 100mL

H.14.14.3.2 Preparación: Solución de trabajo: Adicionar 10mL de la solución concentrada a 90mL de

agua destilada.

H.14.15 Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante.

H.14.15.1 Fórmula.

Ingredientes Cantidades

Peptona 10.0g

Lactosa 10.0g

Sales biliares 20.0g

Verde Brillante 0.0133g

Agua 1L

H.14.15.2 Preparación: Disolver los ingredientes en el agua, calentar si es necesario. Aju star el pH, de tal

manera que después de la esterilización sea 7.0 ± 0.2 a 25°C. Distribuir el medio en frascos de capacidad

necesaria. Esterilizar en autoclave 15 min a 121°C.