Apéndice G — NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos.

Apéndice G Normativo.

Método aprobado para el monitore o de Enterococos fecales recomendado para el monitoreo de

aguas para uso recreativo.

G.1 INTRODUCCIÓN.

Se basa en la filtración de un volumen determinado de una muestra de agua, a través de un filtro de

membrana con un tamaño de poro suficiente para retene r las bacterias (0.45µm). La membrana es colocada

en agar mEI el cual contiene entre otros ingredientes, el cromógeno indoxilß D - glucosido, que debido a la

acción de la enzima ß -Dglucosidasa sintetizada por los enterococos, producen un compuesto azul índi go

alrededor de la colonia que se difunde.

G.2 MATERIALES.

G.2.1 Botellas de dilución de vidrio de boro silicato o frascos de poli-propileno;

G.2.2 Pipetas serológicas de 10mL;

G.2.3 Pipetas serológicas de 1mL;

G.2.4 Pinzas estériles para membrana;

G.2.5 Matraces Kitazato de 1000mL;

G.2.6 Filtros de membranas estériles de tamaño de poro de 0.45µm;

G.2.7 Cajas Petri de vidrio de borosilicato o plástico estériles de 60mm x 15mm o 50mm x 9mm u otro

tamaño apropiado;

G.2.8 Propipeta, y

G.2.9 Manguera de hule para equipo de filtración.

G.3 APARATOS E INSTRUMENTOS.

G.3.1 Potenciómetro con sensibilidad de 0.1 de unidad de pH;

G.3.2 Equipo de filtración con trampa;

G.3.3 Bomba de vacío;

G.3.4 Cuenta colonias;

G.3.5 Incubadora, capaz de mantener una temperatura de 36 °C ± 2°C con termómetro verificado y/o

calibrado, y

G.3.6 Incubadora, capaz de mantener una temperatura de 45°C ± 0.5°C con termómetro verificado y/o

calibrado.

G.4 MEDIOS DE CULTIVO.

G.4.1 BHI;

G.4.2 BHI con 6.5% NaCl;

G.4.3 Agar infusión cerebro corazón;

G.4.4 ABE, y

G.4.5 Agar mEI.

G.5 PROCEDIMIENTO.

G.5.1 Consultar el inciso F.5.1 y colocar la membrana en la superficie del agar mEI e incubar a 41°C ±

0.5°C por 24h. Seleccionar cajas que contengan entre 20 y 80 colonias que independientemente de su color

tengan un halo azul correspondiente a enterococos. Las colonias con halo azul se pueden verificar.

G.5.2 La verificación de las colonias puede ser necesaria para evidenciar cúmulos y también para control

de calidad al implementar la prueba, cambios en los sitios de muestreo, lotes de medio comercial o preparado

por ingredientes. Transferir al menos 10 colonias típicas aisladas a caldo BHI y agar infusión cerebro corazón

inclinado. Incubar los caldos y los agares por 48h a 35°C ± 0.5°C. Después de 24h de in cubación transferir

una asada de los tubos de BHI a ABE y a BHI y BHI con 6.5% de NaCl.

G.5.2.1 Incubar el ABE y el BHI con 6.5% de NaCl a 35°C ± 0.5°C por 48h.

G.5.2.2 Incubar el caldo BHI a 45°C ± 0.5°C por 48h.

G.5.3 Observar crecimiento.

G.5.3.1 Después de las 48h de incubación, hacer una tinción de Gram al crecimiento de los agares de

BHI.

G.5.3.2 Los cocos Gram positivos que crecen e hidrolizan la esculina en ABE (producción de un

precipitado negro o café) y crecen en caldo BHI a 45°C ± 0.5°C y caldo BHI con 6.5% de NaCl a 35°C ± 0.5°C

son confirmados como enterococos.

G.6 Cálculos.

Aplicar la siguiente fórmula para determinar la cantidad de enterococos:

Fórmula 1:

CS = Z x Vs

Vtot

Donde:

CS es el número estimado de UFC en un volumen de referencia de la muestra (100mL)

Z es la suma de colonias contadas en las membranas provenientes de diferentes diluciones d 1, d2…di o de

volúmenes separados de muestras filtradas.

VS el volumen de referencia seleccionado para expresar la concentración de enterococos en la muestra.

Vtot es la suma del volumen total de las porciones probadas de muestra o dilución.

Fórmula 2:

Vtot = (n1V1d1) + (n2V2d2) +………….. (niVidi)

Donde:

n1, n2. ni es el número de membranas filtradas por dilución d1, d2….di

V1, V2 Vi es el volumen analizado en la dilución d1, d2….di o porción de muestra

d1, d2….di es la dilución utilizada por cada porción de volumen analizado V1, V2 Vi (d = 1 para la

muestra sin diluir, d = 0.1 para una dilución 1:10, etc.).

Ejemplo:

Volumen probado Cuentas

100mL 82 colonias

10mL 11 colonias

Z = 82 + 11 = 93

Vtot = (1 x 100 x 1) + (1 x 10 x 1) = 110

y si VS es por 100mL:

Cs = 93 x 100 = 84 UFC/100mL

110

G.6.1 Interpretación de resultados.

La presencia de colonias que independientemente de su color presenten un ha lo azul en agar mEI,

incubado a 41°C ± 0.5°C por 24h, se considera una prueba confirmativa de enterococos.

G.6.2 Criterios de validez de la prueba.

Esta prueba tiene validez si se obtienen cajas que contengan entre 20 a 80 UFC.

Una distribución desigual de las colonias o la presencia de microbiota competitiva, puede interferir con la

diferenciación de colonias positivas debido a la difusión del color a las colonias adyacentes.

G.6.3 Informe de prueba.

Informar como: Enterococos intestinales UFC/100mL.

Si se observan menos de 20 colonias, aplicar la fórmula 1 e informar como valor estimado.

Placas sin colonias, informar como < 1/Vtot UFC/100mL e informar como valor estimado.

Donde: Vtot es la suma del volumen total de las porciones probadas de muestra o dilución.

También se puede informar como “Cero” u “organismos no detectables” indicando el volumen de muestra

analizada.

En caso que se tengan placas con más de 80 colonias, informar como > de 80 UFC/100mL.

G.7 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.

G.7.1 BHI.

G.7.1.1 Fórmula.

Infusión de cerebro de ternera a partir de 200.0g 7.7g

Infusión de corazón de res a partir de 250.0g 9.8g

Proteosa peptona 10.0g

Cloruro de sodio 5.0g

Fosfato disódico 2.5g

Dextrosa 2.0g

Agua destilada 1.0L

G.7.1.2 Preparación: Disolver los ingredientes o 37.0g del medio deshidratado en un matraz con 1L de

agua destilada, distribuir volúmenes de 10mL en tubos de ensaye con tapón de rosca. Esterilizar en autoclave

a 121°C por 15 min. El pH final del medio deberá ser de 7.4 ± 0.2.

G.7.2 BHI con 6.5% de NaCl.

G.7.2.1 Fórmula: BHI con 6.5% de NaCI seguir las instrucciones que en BHI antes descrito, pero

agregando NaCl.

G.7.2.2 Preparación: Agregar 60.0g de NaCl por cada L de medio. Dado que la presentación comercial

deshidratada contiene 5 g de NaCl, esta cantidad deberá restarse de los 65g necesarios por L para obtener

una concentración final de 6.5% de NaCl.

G.7.3 Agar infusión cerebro corazón.

G.7.3.1 Fórmula: El agar BHI contiene los mismos ingredientes que el BHI pero adicionando 5.0g d e agar

por cada L de medio.

G.7.3.2 Preparación: Suspender los ingredientes o 52g del medio agar BHI deshidratado en 1L de agua

destilada. Calentar a ebullición hasta disolver los ingredientes. Distribuir 10mL del medio en tubos con tapón

de rosca y esterilizar a 121°C por 15 min. Después de la esterilización, solidificar inclinado, pH final 7.4 ± 0.2.

G.7.4 ABE.

G.7.4.1 Fórmula.

Extracto de carne 3.0g

Peptona 5.0g

Sales biliares 40.0g

Esculina 1.0L

Citrato férrico 0.5g

Agar 15.0g

Agua destilada 1.0L

G.7.4.2 Preparación: Disolver los ingredientes o 64.0g del medio deshidratado en un 1L de agua

destilada, calentar a ebullición hasta la disolución de los ingredientes.

Distribuir volúmenes de 10mL a tubos con tapón de rosca o frascos. Esterilizar en aut oclave a 121°C por

15 min, Después de esterilizar, solidificar los tubos inclinados o dejar enfriar a 50°C en baño de agua y

distribuir en cajas Petri, dejar solidificar. El pH final del medio es 6.6 ± 0.2. Almacenar en refrigeración.

G.7.5 Agar mEI.

G.7.5.1 Fórmula.

Peptona 10.0g

Cloruro de sodio 15.0g

Extracto de levadura 30.0g

Esculina 1.0g

Actidiona (Cicloheximida) 0.05g

Azida de sodio 0.15g

Agar 15.0g

Agua destilada 1.0L

G.7.5.2 Preparación: Agregar a un matraz, los ingredientes o 71.2g del me dio comercial deshidratado

más 0.75g de indoxyl -ß-D-glucósido a 1L de agua destilada. Calentar a ebullición hasta completa disolución.

Esterilizar a 121°C durante 15 min y enfriar en baño de agua a 50°C.

Reactivos que se agregan después de esteriliza r: Mez clar 0.24g de ácido nalidí xico en 5mL de agua

destilada, agregar unas gotas de NaOH 0.1N hasta disolución y agregar al medio mEI y mezclar. Agregar 0.2g

de cloruro de trifenil tetrazolio (TTC).

Alternativamente se pueden agregar las siguientes soluciones:

a) Ácido nalidíxico. Agregar 0.48g de ácido nalidíxico y 0.4mL de NaOH 10N a 10mL de agua destilada y

mezclar. Esterilizar la solución por filtración y adicione 5.2mL por cada L de medio.

b) Cloruro de trifeniltetrazolium (TTC): Agregar 0.1g de TTC a 10mL de agua destilada y calentar para

disolver. Esterilizar la solución por filtración y adicione 2mL por cada L de medio.

c) Vaciar en cajas de 9mm x 50mm aproximadamente de 4mL a 6mL y dejar solidificar. El pH final del

medio deberá estar entre 7.1 ± 0.2. Conservar en refrigeración.