Apéndice F — NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos.

Apéndice F Normativo.

Método para la determinación de Enterococos fecales en agua técnica de filtración por membrana.

F.1 INTRODUCCIÓN.

El recuento de ent erococos intestinales se basa en la filtración de un volumen determinado de una

muestra de agua, a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro suficiente para retener las

bacterias (0.45µm). La membrana es colocada en un medio selectivo sólido qu e contiene azida de sodio, la

cual inhibe el crecimiento de bacterias Gram negativas. El cloruro de 2, 3, 5 – trifeniltetrazolio es un

compuesto incoloro, que por la acción de los enterococos intestinales, se reduce a formazán de color rojo.

Las colonias típicas de enterococos intestinales, son elevadas de color rojo, marrón o rosa.

Confirmación: si se observan colonias típicas, la prueba de confirmación es necesaria y la membrana se

transfiere a una caja con ABEA (medios solidificados). Los enterococos int estinales hidrolizan la esculina,

dando como producto final la 6, 7 -dihidroxicumarina, que al combinarse con los iones Fe 3+, forman un

compuesto colorido que va desde marrón a negro que se difunde en el agar.

F.2 MEDIOS DE CULTIVO.

PRECAUCIÓN. La azida de sodio es un polvo fino altamente tóxico y mutagénico. Durante su preparación,

deben emplearse guantes, cubrebocas especiales para polvos, lentes de protección y lavarse las manos

inmediatamente después de su preparación.

Los medios que contienen azida no d eben mezclarse con ácidos minerales fuertes, ya que puede

producirse azida de hidrógeno que es tóxica. Las soluciones que contienen azida pueden formar también

compuestos explosivos por contacto con tuberías metálicas, por ejemplo, en los desagües.

Las azidas pueden descomponerse de forma segura, por adición de un exceso de solución saturada de

nitrito.

F.3 MATERIALES.

F.3.1 Botellas de dilución de vidrio de boro silicato o frascos de poli-propileno;

F.3.2 Pipetas serológicas de 10mL;

F.3.3 Pipetas serológicas de 1mL;

F.3.4 Pinzas estériles para membrana;

F.3.5 Matraces Kitazato de 1000mL;

F.3.6 Filtros de membranas estériles de tamaño de poro de 0.45µm;

F.3.7 Cajas Petri de vidrio de borosilicato o plástico estériles de 60mm x 15mm o 50mm x 9mm u otro

tamaño apropiado;

F.3.8 Propipeta, y

F.3.9 Manguera de hule para equipo de filtración.

F.4 APARATOS E INSTRUMENTOS.

F.4.1 Autoclave, capaz de mantener una temperatura de 121°C ± 1°C con termómetro calibrado y/o

verificado;

F.4.2 Potenciómetro con sensibilidad de 0.1 de unidad de pH;

F.4.3 Equipo de filtración con trampa;

F.4.4 Bomba de vacío;

F.4.5 Cuenta colonias, y

F.4.6 Incubadora, capaz de mantener una temperatura de 35°C ± 0.5°C con termómetro verificado y/o

calibrado.

F.5 PROCEDIMIENTO ANALÍTICO.

F.5.1 Filtración e incubación: Conectar el equipo de filtración a la bomba de vacío. Utilizando pinzas

estériles, colocar la membrana con la cuadrícula hacia arriba sobre el portafiltro. Colocar cuidadosamente el

embudo sobre el receptáculo y asegurarlo en su lugar . Abrir la llave de paso y filtrar a través de la membrana,

100mL de muestra aplicando suficiente vacío (aproximadamente 70kPa ( kilo pascal). Cerrar la llave de paso

tan pronto como la muestra haya sido filtrada. Es aconsejable enjuagar el embudo mediante la filtración de 1 a

3 porciones de 10mL a 30mL de diluyente estéril, mientras la membrana permanezca en su lugar.

Inmediatamente después cerrar la llave de paso. Retirar el embudo para dejar expuesta la membrana de

filtración. Colocar la membrana con pinz as estériles en el agar Slanetz & Bartley. Evitar la formación de

burbujas entre la membrana y la superficie del agar. Dejar 30 min y posteriormente incubar las placas

invertidas a 35°C ± 0.5°C durante 48h ± 4h.

F.5.2 Confirmación y Recuento. Las colonias típicas de enterococos son elevadas, de color rojo, marrón o

rosado. Si hay colonias típicas, transferir la membrana con pinzas estériles a una placa con ABE. Incubar a

35°C ± 0.5°C durante 48h ± 4h. Leer la placa inmediatamente después de la incubación. L as colonias típicas

de enterococos intestinales presentan un color marrón a negro alrededor de la colonia. Con ayuda de un

cuenta colonias, seleccionar cajas que contengan entre 20 y 60 colonias típicas y contar el número de UFC.

Nota: Una distribución des igual de las colonias o la presencia de microbiota competitiva, puede interferir

con la diferenciación de colonias positivas debido a la difusión del color a las colonias adyacentes.

F.6 Cálculos.

Aplicar la siguiente fórmula para determinar la cantidad de enterococos:

Fórmula 1:

CS = _Z_ x Vs

Vtot

Donde:

CS es el número estimado de UFC en un volumen de referencia de la muestra (100mL)

Z es la suma de colonias contadas en las membranas provenientes de diferentes diluciones d 1, d2….di o

de volúmenes separados de muestras filtradas.

VS el volumen de referencia seleccionado para expresar la concentración de enterococos en la muestra.

Vtot es la suma del volumen total de las porciones probadas de muestra o dilución.

Fórmula 2:

Vtot = (n1V1d1) + (n2V2d2) +………….. (niVidi)

Donde:

n1, n2, ni es el número de membranas filtradas por dilución d1, d2….di

V1, V2, Vi es el volumen analizado en la dilución d1, d2….di o porción de muestra

d1, d2…di es la dilución utilizada por cada porción de volumen analizado V 1, V2, Vi (d = 1 para la muestra

sin diluir, d = 0.1 para una dilución 1:10, etc.)

Ejemplo:

Volumen probado Cuentas

100mL 82 colonias

10mL 11 colonias

Z = 82 + 11 = 93

Vtot = (1 x 100 x 1) + (1 x 10 x 1) = 110

y si VS es por 100mL:

Cs = 93 x 100 = 84 UFC/100mL

110

F.6.1 Interpretación de resultados.

La presencia de colonias color marrón a negro alrededor de la colonia en ABE, incubado a 35°C ± 0.5°C

durante 48h ± 4h, se considera una prueba confirmativa de la presencia del género Enterococcus.

F.6.2 Criterios de validez de la prueba.

Esta prueba tiene validez si se obtienen cajas que contengan entre 20 a 60 UFC.

Una distribución desigual de las colonias o la presencia de microbiota competitiva, puede interferir con la

diferenciación de colonias positivas debido a la difusión del color a las colonias adyacentes.

F.7 Informe de prueba.

F.7.1 Informar como: Enterococos intestinales UFC/100mL.

F.7.2 Si se observan menos de 20 colonias, aplicar la fórmula 1 e informar como valor estimado.

F.7.3 Placas sin colonias, informar como < 1/Vtot UFC/100mL e informar como valor estimado.

Donde: Vtot es la suma del volumen total de las porciones probadas de muestra o dilución (ver inciso F.6).

También se puede informar como “Cero” u “organismos no detectables” indicando el volume n de muestra

analizada.

F.7.4 En caso que se tengan placas con más de 60 colonias, informar como > de 60 UFC/100mL.

F.8 MEDIOS DE CULTIVO.

F.8.1 Medio Slanetz y Bartley. (Agar mEnterococos)

F.8.1.1 Medio base.

Ingredientes Cantidad

Triptosa 20,0g

Extracto de Levadura 5,0g

Glucosa 2,0g

Fosfato dipotásico, K2HPO4 4,0g

Azida de Sodio NaN3 0.4g

Agar 8g a 18g* (* La cantidad de agar depende de la

gelificación del agar)

Agua 1L

Disolver los ingredientes en 1L de agua hirviendo. Calentar durante 5 min más. Enfriar entre 50°C y 60°C.

F.8.1.2 Solución de TTC 0.1%.

Ingredientes Cantidad

Cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio TTC 1.0g

Agua 100mL

Disolver el indicador en 100mL de agua, agitando constantemente. Esterilizar por filtración (0,2µm de

poro). Proteger la solución de la luz. Descartar cuando aparezca una coloración rosa.

F.8.1.3 Medio Completo.

Ingredientes Cantidad

Medio Base 1L

Solución de TTC 10mL

Adicionar la solución de TTC sobre el medio base enfriado a una temperatura de 50°C a 60°C. El pH

después de la esterilización debe ser de 7.2 ± 0.1 a 25°C. Distribuir en placas de Petri. Dejar solidificar sobre

una superficie horizontal fría. Conservar en la oscuridad por 2 semanas a 5°C ± 3°C.

F.8.2 ABE.

Ingredientes Cantidad

Extracto de Carne 3.0g

Peptona 5.0g

Bilis de buey deshidratada 40.0g

Esculina 1.0g

Citrato Férrico 0.5g

Agar de 8g a 18g* (* Dependiendo de la gelificación del agar)

Agua 1L

Calentar para disolver los ingredientes. Esterilizar a 121°C ± 2°C durante 15 min. No sobrecale ntar. El pH

después de la esterilización debe ser de 6.6 ± 0.2. Distribuir en placas Petri para obtener un espesor de 3mm

a 5mm. Dejar solidificar en una superficie horizontal. Almacenar de 2°C a 10°C.