Apéndice A — NOM-003-SAGARPA-2016, Relativa a las características de sanidad, calidad agroalimentaria, autenticidad, etiquetado y evaluación de la conformidad del jarabe de agave.

APÉNDICE A

MÉTODO DE PRUEBA PARA EL ANÁLISIS DEL PERFIL DE CARBOHIDRATOS DEL JARABE DE

AGAVE

1. Introducción.

El método de prueba busca determinar los siguientes componentes característicos del jarabe de agave y

evidenciar los marcadores que demuestren la adulteración del mismo en base a lo siguiente:

Perfil de carbohidratos, antes y después de hidrólisis con amiloglucosidasa.

Perfil de carbohidratos antes y fructosa después de hidrólisis con fructanasa.

Aumento de los niveles de glucosa y fructosa después del tratamie nto con amiloglucosidasa y fructanasa

como potencial marcador de adulteración con jarabe de maíz o fructooligosacáridos (FOS).

Determinación de fructosa, glucosa, difructosa/sacarosa, sorbitol, manitol e hidroximetilfurfural (HMF).

Cuantificación de fructanos y determinación del DP promedio.

2. Objetivo y campo de aplicación.

El presente método es utilizado para la detección de adulterantes en jarabe de agave, así como para la

cuantificación de los principales carbohidratos presentes en este mismo (fructosa , glucosa,

sacarosa/difructosa, manitol, sorbitol) así como el hidroximetilfurfural.

De manera alterna, al poder cuantificar la fructosa y glucosa, el tratamiento con fructanasa permite

determinar el contenido de fructanos y su DP promedio en una muestra.

3. Principio/fundamento.

3.1 Componentes característicos del jarabe de agave y marcadores aptos para adulteración

(difructosa/sacarosa, sorbitol, manitol y HMF).

El análisis del perfil del jarabe de agave se debe llevar a cabo a concentraciones al tas de gl ucosa y

fructosa (10–15 µg de azúcar por inyección) para la determinación correcta de los niveles de estos azúcares;

pues esas concentraciones están fuera del rango del detector. S ólo los polioles –sorbitol y manitol–así como

la difructosa/sacarosa y el HMF los que pueden ser determinados al ser comparados con los mismos.

El jarabe de agave muestra perfiles característicos de sus componentes, antes y después de hidrolizarlo

con fructanasa o amiloglucosidasa altamente purificadas, o una combinación de ambas enzimas. Los perfiles

después de la hidrólisis con fructanasa de alta pureza, así como de la combinación de fructanasa y

amiloglucosidasa son idénticos y muestran un perfil de compuestos característicos del proceso de producción.

En las pruebas de detecció n de adulteración con jarabe de maíz de alta fructosa (HFCS 43%, HFCS 55%

y/o HFCS 90%, por sus siglas en inglés), jarabe de maíz de glucosa pura, jarabe de maíz de glucosa con

diferentes equivalentes de dextrosa (DE), azúcar invertido, fructosa pura y sac arosa no se observan los

compuestos característicos en el perfil del jarabe de agave originados por las condiciones de proceso. La

presencia de compuestos adicionales (ej. maltooligómeros) no es evidente en el análisis del perfil de

carbohidratos, pues estos compuestos pueden esconderse al co -eluir con compuestos propios del agave. Sin

embargo, la comparación de los perfiles antes y después del tratamiento con fructanasa o amiloglucosidasa, o

una combinación de ambas, permite demostrar la adulteración de la muestra.

El contenido de glucosa en jarabe de agave puro y aumento de la misma después de hidrolizarlo con la

enzima amiloglucosidasa originado por la posible adulteración con productos de jarabe de maíz. Para el

análisis correcto del contenido de glucosa , la muestra tiene que ser diluida en proporción 1:5. Las soluciones

estándar de glucosa aplicadas (por lo menos a 3 concentraciones diferentes) tienen que estar en el mismo

rango.

El aumento en el contenido de glucosa y fructosa del jarabe de agave puro después de hidrolizarlo con la

enzima fructanasa pueden ser originados al incluir fructooligómeros no procesados por completo o en caso de

adulteración al añadir jarabe de fructanos (de agave u otras fuentes). Para el análisis correcto del contenido

de fructosa, la muestra tiene que ser diluida 1:20. Las soluciones estándar de fructosa aplicadas (por lo menos

a 3 concentraciones diferentes) tienen que estar en el mismo rango.

3.2 Determinación de fructosa, glucosa, difructosa/sacarosa, sorbitol, manitol e h idroximetilfurfural (HMF)

en las muestras de jarabe y fructanos de agave.

El contenido de difructosa/sacarosa, sorbitol, manitol y HMF pueden ser calculados a partir de las áreas

obtenidas por el equipo después de su correcta calibración y utilizando la mu estra directamente. El contenido

de fructosa y glucosa só lo puede ser calculado al diluir el jarabe a niveles adecuados. En particular, el

intervalo de linealidad, y donde hay una gran reproducibilidad en la cuantificación de la fructosa es muy

limitado (entre 10 y 150 µg/ml).

4. Equipos y materiales.

Cromatógrafo de intercambio iónico (HPAEC): Bomba cuaternaria con gradiente para cromatografía de

líquidos con módulo desgasificador de eluente, horno para columna, detector electroquímico de pulso

funcionando en modo de detección de pulso amperométrico (PAD con amperometría integrada) y

automuestreador. Con software para control del cromatógrafo, adquisición de datos y su análisis.

Columna para sistema capilar cuya fase estacionaria y dimensiones sea capaz de separar los

componentes a cuantificar, con las siguientes características:

Columna cromatográfica (HPAEC): 250 X 4 mm d.i. con pre-columna (50 x 4 mm d.i.) con resina específica

de intercambio aniónico, tal como una columna de sustrato de poliestireno com 2% de entrecruzamiento con

divinilbenceno y aglomerado con microcuentas de 500 nanómetros de latex funcionalizado con grupos

cuaternarios de amonio y 10 micrómetros de tamaño de partícula con, aproximadamente 100

microequivalentes por columna.

Balanza analítica. Sensibilidad de 0.01 mg.

Horno de vacío. Con capacidad de mantener 55 ± 3ºC.

Botellas de vidrio o plástico. De 100 a 150 ml de capacidad, con tapa roscada.

Desecador. Con SiO2, o desecante equivalente. Secar el desecante cada 2 semanas dejándolo 8 horas a

130ºC en el horno a vacío.

Matraces volumétricos. 1 y 2 L de capacidad.

Agitador magnético y barras de agitación de diferentes tamaños.

Tubos cónicos de plástico para reacción (Tubos Safe -Lock).- 2.0 ml (No. 0030 120.094 para

microcentrífuga) o equivalentes.

Racks para tubos cónicos de plástico para reacción.

Calentador eléctrico con agitación.- Rango de temperatura de 4 a 99 °C para tubos cónicos de reacción de

2.0 ml (24x) o equivalente.

Baño ultrasónico.

Agitador tipo Vortex.

Micropipetas automáticas de volumen variable: incluyendo volúmenes de 500 a 5000 µL, 500 a 2500 µL,

200 a 1000 µL, 50 a 200 µL, 5 a 50 µL y 2 a 20 µL.

Filtro para jeringa. Tamaño del poro de 0.2 ó 0.45 µm, Nylon.

Jeringas. Punta Luer Lock, capacidad de 1 ml, de plástico.

Equipo de filtrado al vacío. - diámetro de 48 mm y capacidad del recipiente y embudo de 1 l.

Filtro de nylon o de acetato de celulosa. - 48 mm de diámetro.

Unidad de ultrafiltración por centrifugado.

5. Preparación de la muestra y reactivos.

Reactivos

Agua. Toda el agua debe de ser ASTM Tipo 1 o equivalente.

Solución de Hidróxido de sodio. NaOH a concentración del 50% (w/w), libre de carbonatos, densidad de

1.50 g/ml.

Acetato de sodio anhidro. Grado reactivo, ACS.

Sorbitol. Grado estándar cromatográfico.

Manitol. Grado estándar cromatográfico.

Glucosa. Grado estándar cromatográfico.

Fructosa. Cristalina, Grado estándar cromatográfico.

Sacarosa. Cristalina, Grado estándar cromatográfico.

Hidroximetilfurfural. Grado estándar cromatográfico.

Hidróxido de potasio: en granalla, grado ACS o equivalente.

Sulfato de calcio. Con indicador de humedad, malla # 6 (Drierite o similar).

Fructanasa. Mezcla liofilizada de fructanasas, (exo - inulinasa 20 000 U, endo -inulinasa 650 U en 36 mg).

Almacene a -20°C cuando no se use.

Amiloglucosidasa. Amiloglucosidasa liofilizada con 36 000 U/g. Almacene a -20°C cuando no se use.

6. Preparación de los reactivos.

Eluentes

Fase móvil A:

Solución de NaOH 200 mM, libre de carbonatos. Preparar las soluciones libre de carbonatos como se

indica a continuación: Desgasificar 2 L de H2O durante al menos 15 minutos con helio o argón en una botella

de eluente del cromatógrafo (y/o con ayuda del baño ultrasónico). Agregar aproximadamente 800 mL de H2O

desgasificada en un matraz aforado de 1 L. Con una pipeta automática adicionar 10.4 mL de solución de

NaOH 50% w/w a la solución sin agitar o mezclar, aforar cuidadosamente con H2O. Continuar desgasificando

la solución en el baño ultrasónico y burbujeando helio o argón durante 30 minutos más antes de utilizarla.

Fase móvil B:

Solución 100 mN de NaOH + 700 mM de acetato de sodio, libre de carbonato. Desgasificar H2O como se

indica para la fase móvil A. Agregar aproximadamente 800 mL de H2O desgasificada en un matraz aforado de

1 L y añadir lentamente 57.4 g de acetato de sodio anhidro evitando la formación de grumos. Una vez disuelto

adicionar con una pipeta automática 5.2 mL de solución de NaOH 50% w/w sin agitar o mezclar, aforar

cuidadosamente con H2O.

Fase móvil C:

Agua tipo 1.

Fase móvil D:

Solución 500 mM de NaOH, libre de carbonatos. Desgasificar H2O como se indica para la fase móvil A.

Agregar aproximadamente 800 mL de H2O desgasificada en un matraz aforado de 1 L y con una pipeta

automática adicionar 26.1 mL de solución de NaOH 50% w/w a la soluc ión sin agitar o mezclar, aforar

cuidadosamente con H2O. Continuar desgasificando la solución en el baño ultrasónico durante 30 minutos

más antes de utilizarla.

Nota: Todas las soluciones móviles deberán de ser filtradas a través de un filtro de 0.22 µm de spués de

ser aforadas.

Es de suma importancia evitar la carbonatación de las fases móviles por absorción del CO2 atmosférico.

Para evitar esto, los eluentes se deben de mantener bajo atmosfera de helio, o de manera alternativa, se

pueden aplicar filtros de descarbonización en la parte superior de las botellas de eluente. Preparación del

filtro: tomar una jeringa de 30 ml y remover el pistón, rellenar la jeringa con capas de algodón o lana de vidrio,

drierite (sulfato de calcio anhidro) o gel de sílice, hidr óxido de potasio (sólido), drierite o gel de sílice, algodón

o lana de vidrio, cerrar la boca ancha de la jeringa con parafilm y perforarlo para permitir la entrada de aire.

7. Purificación y preparación de las enzimas.

Fructanasa. Disuelver 5 mg (2750 U exo-inulinasa y 90 U endo-inulinasa) en 500 µL de H2O en un tubo de

reacción de 2 ml y transferir a una unidad de ultrafiltración. Centrifugar durante 8 minutos a 13 000 rpm y

remueva el filtrado, llene nuevamente la unidad de ultrafiltración con 500 µL de H2O, mezcle cuidadosamente

la solución y centrifugue otra vez, repita el proceso de lavado cuatro veces. Una vez finalizado el lavado,

mezcle la solución de enzima purificada con 500 µL de H2O, transfiérala a un tubo de reacción y llene hasta 2

mL (1400 U exo-inulinasa y 45 U endoinulinasa por mililitro). Alicuotar dependiendo de los volúmenes a utilizar

y almacenar a -20 °C.

Amiloglucosidasa. Disuelva 15 mg (~550 U) en 500 µL de H2O (en un tubo de reacción de 2 mL) y

transfiera a una unidad de ultrafiltra ción. Centrifugue durante 8 minutos a 13,000 rpm y remueva el filtrado de

la parte inferior. Llene nuevamente la unidad de ultrafiltración con 500 µL de H2O, mezcle cuidadosamente la

solución y centrifugue otra vez, repita el proceso de lavado cuatro veces . Una vez finalizado el lavado, mezcle

la solución de la enzima purificada con 500 µL de H2O, transfiérala a un tubo de reacción y llene hasta 2 mL

(270 U/mL). Alicuotar dependiendo de los volúmenes a utilizar y almacenar a -20 °C.

8. Soluciones estándar de azúcares y alcoholes de azúcares.

Secar la glucosa, fructosa y sacarosa en un horno al vacío durante 24 horas a 55 ± 3°C. (Nota: no seque

el sorbitol y el manitol). Prepare series adecuadas de estándares en las concentraciones correctas para el

análisis. Aplique diferentes rangos de concentraciones para glucosa y fructosa y compruebe la linealidad de la

curva de calibración para ambos azúcares.

Nota: La fructosa diluida en una solución acuosa es más inestable que la glucosa. Controle las soluciones

estándar y muestras para una eventual pérdida de concentración de fructosa. Almacenar todas las soluciones

estándar y muestras a 4°C. Preparar soluciones diluidas frescas y evitar que las muestras permanezcan

mucho tiempo en el automuestreador antes de ser analizadas.

Las soluciones estándar para la calibración pueden ser preparadas siguiendo estas instrucciones:

Preparación de la solución stock: Pesar en la relación correcta (composición aproximada del jarabe a

analizar) la fructosa, glucosa, sacarosa, sorbitol, manitol y HMF. Disolver en aproximadamente 50 ml en un

matraz aforado de 100 ml. Una vez disuelto, aforar a los 100 ml. En el ejemplo se pesaron exactamente: 5.8

mg de sorbitol, 6.7 mg de manitol, 16.4 mg de HMF, 20.0 mg de glucosa, 186.3 mg de fructosa y 5.7 mg de

sacarosa en 100 mL.

Diluir la solución stock a varios niveles para obtener de 4 a 5 soluciones estándares para su análisis y

construcción de la curva de calibración.

9. Preparación de muestras de Jarabe de Agave.

Tabla 1: Diluciones de Jarabe de Agave para hidrólisis enzimática.

A1 Jarabe de agave 600L solución stock 1400 L H2O1 puro

A2 Jarabe de agave 600L solución stock 40 L Amiloglucosidasa +

1360 µL H2O2

AG

A3 Jarabe de agave 600L solución stock 40 L Fructanasa + 1360 µL H2O2 FN

A4 Jarabe de agave 600L solución stock 40 L Amiloglucosidasa +

40 L Fructanasa + 1320µL H2O2

AG+

FN

B1 Blanco amiloglucosidasa 600L H2O 40 L Amiloglucosidasa +

1360 µL H2O2

BA

B2 Blanco fructanasa 600L H2O 40 L Fructanasa + 1360 L H2O2 BF

Se debe pesar con exactitud 250 mg de Jarabe de Agave (±0.01 mg) en una botella de plástico de 100

mL, añada 50 mL de H2O y disuelva completamente. A partir de esta solución stock prepare las siguientes

muestras para hidrólisis enzimática en tubos de reacción de 2 mL utilizando el rack para tubos:

A) Sin tratamiento enzimático;

B) después del tratamiento enzimático

Cerrar los tubos de reacción y agite durante 15 segundos en el agitador tipo Vortex. Colocar los tubos de

reacción A2, A3, A4, B1, B2 (el control de la enzima es necesario únicamente después de cada nueva

preparación de la misma, la ausencia de azúcares en el perfil confirma la purificación óptima en la preparación

de la enzima) en el calentador eléctrico con agitación (Eppendorf Thermo Mixer C o equival ente) y lleve a

45°C durante 30 minutos agitando a 300 rpm. A continuación aumentar la temperatura hasta 80°C y mantener

por 20 minutos con agitación continua de 300 rpm (para detener la hidrólisis). Posteriormente enfriar los tubos

a temperatura ambiente en el rack, abrir los tubos y llenar con H2O hasta 2 mL. cerrar los tubos nuevamente y

mezclar en agitador tipo Vortex (15 segundos) para obtener una muestra que se encuentre en condiciones

óptimas.

Posteriormente llenar para cada una de las muestras una j eringa de 1 mL con las soluciones de las

muestras (A1, A2, A3, A4, B1, B2), colocar un filtro para jeringa (Tamaño de poro 0.45 µm, Millipore Millex HN,

13 mm o equivalente) y filtrar la solución en un vial adecuado para el automuestreador (1.5 mL), cerrar el vial y

colocar en la posición adecuada de la bandeja del automuestreador para su análisis , filtrar el resto de las

soluciones de las muestras en nuevos tubos de reacción de 2 mL para las diluciones adicionales. Utilizar para

cada muestra una jeringa y filtro para jeringa nuevos.

A5 Contenido de glucosa 200L muestra A1 800 L H2O Dilución 1:5

A6 Contenido de glucosa

después de tratamiento

con AG

200L muestra A3 800 L H2O Dilución 1:5

A7* Contenido de fructosa y

glucosa

100L muestra A1 1900 L H2O Dilución 1:20

A8* Contenido de fructosa y

glucosa después de

tratamiento con FN

100L muestra A2 1900 L H2O Dilución 1:20

Tomar diferentes diluciones para el análisis del contenido de glucosa (glc) y fructosa (fru) en jarabe de

agave puro y después de hidrólisis enzimática (con amiloglucosidasa y fructanasa)

Tabla 2: Diluciones para la determinación de glucosa y fructosa.

* La concentración de la fructosa debe de estar entre 10 y 150 µg/ml

Llenar con las muestras A5 a A8 sus respectivos viales (1.5 mL) filtrando las soluciones, cerrar los viales y

colocarlos en la posición adecuada de la bandeja del automuestreador para su análisis.

10. Procedimiento.

Método 1. Adulteración y cuantificación de azúcares.

Condiciones del cromatógrafo (HPAEC): temperatura d e columna, 30 ± 0.5°C; velocidad de flujo, 1.0

mL/min; volumen de inyección, 10 L; sensibilidad del detector, rango análogo 1-3 C.

Tabla 3: Gradiente de concentración de eluentes para el análisis del perfil del jarabe de agave y

determinación del conten ido de sorbitol, manitol, glucosa, fructosa, difructosa y sacarosa por sistema Dionex

con columnas CarboPac PA1 (columna y pre-columna).

Tiempo, min % fase móvil

A B C D

200 mM NaOH 200 mM NaOH

+700 mM NaAc

Agua 500 mM NaOH

-20 Equilibrio

-20 50 0 50 0

-10 50 50

-9.9 50 1 49 0

0 corrida

6 50 1 49 0

12 50 4 46 0

30 50 20 30 0

40 50 40 10 0

40.1 100 0 0 0

50 Fin corrida

NOTA: Ver Tabla 3 para el gradiente del eluente y Tabla 4 para el programa de tiempo del detector.

Tabla 4: Programa del tiempo del detector PAD para análisis de azúcares.

Tiempo, s Voltaje, V

0.00 0.05

0.20 0.05

0.40 0.05

0.41 0.65

0.60 0.65

0.61 -0.10

1.00 -0.10

Método 2. Sólo cuantificación de azúcares/determinación de contenido de fructanos

De manera alternativa al método de gradiente presentado, se puede llevar a cabo la separación y

cuantificación con un método isocrático utilizando NaOH 80 mM. El tiempo de corrida es de s ólo 15 minutos,

seguido de una limpieza por 17 minutos y un tiempo de equilibrado de 20 min , resultando en un tiempo de

separación total de 52 minutos. Las curvas de calibración resultantes son similares a las del método de

gradiente, y el análisis de glucosa y fructosa resulta excelente con este sistema. El tratamiento con fructanasa

permite analizar el contenido de fructanos en la muestra (ver Tabla 3).

Tabla 5. Programa para el análisis de sorbitol, manitol, HMF, glucosa, fructosa y sacarosa/difructosa con

columna Carbopac PA1 con NaOH 80 mM.

Tiempo, min % fase móvil

A B C D

200 mM NaOH 200 mM NaOH

+700 mM NaAc

agua 500 mM NaOH

-20 Equilibrio

-20 50 0 50 0

-10 50 50

-9.9 40 0 60 0

0 corrida

15 40 60 0

15.1 limpieza

15.1 15 70 15 0

23 15 70 15 40

23.1 0 0 0 100

32 Paro de corrida

El programa del detector PAD es idéntico al del método de gradiente (ver tabla 4).

Análisis de estándares

Diferentes concentraciones de la solución stock fueron analizadas considerando la respuesta lineal del

detector PAD. La figura 1 muestra el perfil de la solución estándar en dilución 1:10.

Para obtener resultados precisos de las concentraciones de los azúcares aplique las soluciones estándar

de los mismos por lo menos a 3 diferentes concentraciones, y de ser posible por duplicado, en cada secuencia

de corridas de muestras de jarabe de agave.

Nota: Las áreas de los picos de los azúcares son fuertemente influenciadas por las condiciones de la

corrida durante la separación y son muy sensibles. En general, s ólo la calibración externa con diferentes

concentraciones de azúcares es recomendada. En este cas o los factores de respuesta de los azúcares en las

muestras se relacionan con la respuesta del compuesto estándar por sí mismo. El valor de coeficiente de

correlación (R2) no debe de ser menor a 0.99.

Se debe asegurar que el mismo tipo de integración se ut ilice tanto para muestras como para estándares.

Se debe elegir el mismo ancho para los picos, y las mismas configuraciones y parámetros de integración. Se

debe controlar cuidadosamente la selección de la línea base. Utilice sólo el área del pico para cuantificarlo.

Fig.1 Perfil cromatogr áfico de soluciones estándar: glucosa ( 22 µg.mL -1; tret: 5.04 min), fructosa (186.3

µg.mL-1; tret: 5.75 min), sacarosa, ( 5.7 µg.mL -1; tret: 8.79 min), sorbitol ( 5.8 µg.mL-1; tret: 2.43 min), manitol

(6.7 µg.mL-1; tret: 2.72 min), y HMF (16.4 µg.mL-1 tret: 4.03 min); volumen de inyección: 10 µL.

11. Análisis de muestras.

Para el análisis de una muestra de jarabe de agave se requieren 8 corridas de A1 a A8. Adicionalmente, 2

corridas para los blancos de las enzimas y entre 6 y 8 corridas para las soluciones estándar (sorbitol, manitol,

HMF, sacarosa, glucosa y fructosa) son recomendables. Bajo estas condiciones, escriba la secuencia para el

análisis y aplique el programa recomendado para la separación, ver Tabla 3. El tiempo de cada corrida es de

70 minutos y el flujo para la separación de 1 mL/min a 30°C.

Después de terminada la secuencia (alrededor de 50 corridas) limpie la columna y el detector con solución

0.5 M de NaOH durante 1 hora a un flujo de 1 mL/min. Para determin ar el contenido de sorbitol, manitol,

difructosa y sacarosa se pueden tomar las áreas de los picos del cromatograma del jarabe de agave puro. La

calibración de estos componentes se realiza con las soluciones estándar de sorbitol, manitol HMF y

difructosa/sacarosa. El contenido de difructosa puede ser calculado con la curva de calibración de sacarosa.

El contenido de glucosa y fructosa es calculado correctamente s ólo con el área de los picos después de sus

respectivas diluciones.

12. Evaluación de los resultados.

Adulteración de jarabe de agave con jarabe de maíz de alta fructosa (HFCS) o jarabe de maíz:

El perfil del jarabe de agave cambia en el rango de los maltooligómeros al ser eliminados por medio de

hidrólisis con amiloglucosidasa. Adicionalmente, el contenido de glucosa aumenta después de la hidrólisis con

amiloglucosidasa.

Adulteración con otros suplementos o el jarabe de agave es mezclado con otros compuestos extraños:

El perfil del agave no incluye los picos característicos del proceso de producción.

Contenido de fructooligómeros:

El perfil del jarabe de agave incluye el perfil de los fructooligosacáridos (FOS) y puede ser removido

después de hidrólisis con fructanasa.

Contenido de fructosa, glucosa, sacarosa, manitol sorbitol y HMF.

Los resultados so n calculados a partir de la muestra original utilizada y sus subsecuentes diluciones

después de comparar las áreas obtenidas en el análisis de la muestra contra la curva de calibración

construida con las diferentes diluciones de los estándares.

Contenido de Fructanos.

Para determinar el contenido de fructanos, después de tratar con fructanasa la muestra, al contenido

corregido de fructosa y glucosa (es decir, restando la fructosa, glucosa y sacarosa libre presente en el

producto y aplicando el factor de corrección de 0.9 se obtiene el contenido de fructanos en la muestra

El DP promedio es calculado dividiendo el contenido de fructosa corregido entre el contenido de glucosa

libre. Esto asume una molécula de glucosa por molécula de fructano.

Fig. 2 Perfil del jarabe de Agave sin ningún tratamiento (1.5 mg de jarabe/mL); volumen de inyección 10

µL; picos identificados: 1 – sorbitol, 2 – manitol, 3 – HMF (Hidroximetilfurfural), 4 – glucosa y fructosa, 5 –

sacarosa/difructosa, 6 – picos sin identificar.

En este perfil, el contenido de sorbitol, manitol y HMF puede ser determinado con el área bajo el pico.

A) Jarabe antes y después de hidrólisis enzimática (muestras A1 – A4)

Fig. 3 Perfil de muestras de jarabe de Agave (1.5 mg de jarabe/mL); volumen de inyección 10 µL; a –

jarabe puro (A1), b – jarabe después de hidrólisis con fructanasa (A2), c – jarabe después de hidrólisis con

amiloglucosidasa (A3), d – jarabe después de hidrólisis con fructanasa y amiloglucosidasa (A4)

Los perfiles no muestran cambios antes y después de la hidrólisis enzimática. Este hecho permite concluir

que esta muestra de jarabe de agave no incluye fructooligómeros o picos extraños ocasionados por series de

maltooligómeros. Los picos característicos del perfil pueden ser únicamente debid os al proceso de producción

o a componentes de la planta que no puedan ser removidos a través de la clarificación y purificación del

jarabe.

B) Muestra de jarabe de Agave: antes y después de hidrólisis enzimática (muestra A1 – A4)

Fig. 4 Perfil de muestras de jarabe de Agave (1.5 mg de jarabe/mL); volumen de inyección 10 µL; a –

jarabe puro (A1), b – jarabe después de hidrólisis con fructanasa (A2), c – jarabe después de hidrólisis con

amiloglucosidasa (A3), d – jarabe después de hidrólisis con fructanasa y amiloglucosidasa (A4)

Los perfiles después de hidrólisis con fructanasa (b) así como fructanasa y amiloglucosidasa (d) pierden

algunos picos que eran de fructooligómeros (picos significativos de difructosa, ver pico después de los 8

minutos, pico antes de los 12 minutos, pico entre los 18 y 19 minutos). S ólo la hidrólisis con amiloglucosidasa

presenta el mismo perfil que el puro. Esto permite concluir que este jarabe de agave incluye fructooligómeros

pero no picos extraños de maltooligómeros. El otro pico puede ser originado sólo por el proceso de producción

o por componentes propios de la planta que no pueden ser removidos por clarificación y purificación del

jarabe.

C) Jarabe de Agave Adulterado (WAS, 80% adulteración con jarabe de maíz), con la siguien te

composición:

17.6 g HFCS 55% (incluye aproximadamente 0.35 (2% w/w) de maltooligómeros, principalmente

isomaltotriosa e isomaltotetraosa)

+ 62.4 g HFCS 90% (sin maltooligómeros)

+ 20 g jarabe de agave oscuro

+ 300 mg FOS

La figura 5 muestra el perfil de separación del jarabe de maíz de alta fructosa 55% (HFCS 55%) con 0.15

mg de jarabe/mL antes y después de hidrólisis con amiloglucosidasa y fructanasa. Los picos de isomaltotriosa

e isomaltotetraosa pueden ser eliminados con amiloglucosidasa. Este hecho indica la posible adulteración con

jarabe de maíz.

Fig. 5 Perfil del jarabe de maíz de alta fructosa 55% (HFCS 55%) (0.15 mg de jarabe/mL); volumen de

inyección 10 µL; antes y después de hidrólisis con amiloglucosidasa. 1 – isomaltotriosa, 2 – isomaltotetraosa,

3 – glucosa, 4 – fructosa.

La figura 6 muestra el perfil de una imitación de jarabe de agave (WAS) con 1.5 mg de jarabe/mL. El

jarabe WAS puro (7a) muestra un pequeño pico de sacarosa (pico 1) y dobles o triples picos en las posiciones

2 y 3. Después de hidrolizarlo con ambas enzimas (7d) el pico 1 desaparece y en las posiciones 2 y 3 s ólo se

encuentran unos picos muy pequeños. Este perfil no se ajusta al perfil del jarabe de agave certificado por lo

que puede asumirse una posible adulteración con jarabe de maíz.

Esta suposición puede respaldarse con los resultados del perfil de separación después de hidrolizar s ólo

con fructanasa (7b) y con amiloglucosidasa (7c). Después de la hidrólisis con fructanasa, el pico 1 (sacarosa)

desaparece, el pico 2 se reduce a un pico de menor tamaño (parte de este pico era FOS) y el pico 3

permanece sin cambios. Después de hidrolizar con amiloglucosidasa, el pico 1 no cambia, el pico 2 se reduce

significativamente (parte del pico es un maltooligómero) y el pico 3 tambi én es reducido a un pico de menor

tamaño (parte del pico también es un maltooligómero).

Para una mejor apreciación de los picos 2 y 3 la figura 7 muestra estos picos en detalle.

Fig. 6 Perfil de la imitación de jarabe de Agave (WAS, 80% adulterado con jara be de maíz) (1.5 mg de

jarabe/mL); volumen de inyección 10 L; a – WAS puro (A1), b – WAS después de hidrólisis con fructanasa

(A2), c – WAS después de hidrólisis con amiloglucosidasa (A3), d – WAS después de hidrólisis con fructanasa

y amiloglucosidasa (A4).

Fig. 7 Perfil de la imitación d e jarabe de Agave (WAS, 80% adulterado con jarabe de maíz) (1.5 mg de

jarabe/mL); rango entre 12 y 22 minutos de separación; volumen de inyección 10 L; a – WAS puro (A1), b –

WAS después de hidrólisis con fructanasa (A2), c – WAS después de hidrólisis con amiloglucosidasa (A3), d –

WAS después de hidrólisis con fructanasa y amiloglucosidasa (A4).

En la Figura 7 el detalle del pico 2 muestra un doble pico en la inyección con jarabe puro (8a), con

fructanasa sólo se percibe un pico (8b), con amiloglucosidasa el pico dominante puede ser removido (8c) s ólo

queda presente la parte de FOS; con ambas enzimas s ólo un pequeño pico se mantiene visible. El detalle del

pico 3 muestra en la inyección de jarabe puro un pico triple, el cual no puede ser removido con fructanasa,

sólo con amiloglucosidasa es posible remover el pico intermedio. Ambos picos, que pudieron ser removidos

por la amiloglucosidasa eran los maltooligómeros provenientes del HFCS 55% y confirma la adulteración con

el mismo.