Apéndice V — NOM-004-SEMARNAT-2002, Protección ambiental.- Lodos y biosólidos.-Especificaciones y límites máximos permisibles de contaminantes para su aprovechamiento y disposición final.

ANEXO V

METODO PARA LA CUANTIFICACION DE HUEVOS DE HELMINTOS EN LODOS Y BIOSOLIDOS

El presente método tiene por objeto establecer la técnica para la detección, enumeración , determinación y

de la viabilidad, en caso requerido, de huevos de helmintos en muestras de lodos y biosólidos, con el fin de

evaluar la calidad de estos subproductos y la eficiencia de los sistemas de tratamiento a los que están sujetos.

1. Principio

La prueba se basa en el siguiente principio:

1.1 Por medio de lavados continuos, combinados con diversas etapas de filtración y flotación se logra la

separación de los huevos de helmintos del resto de las partículas de mayor y menor tamaño, así como su

concentración.

1.2 Permite, en caso de ser requerido, determinar la viabilidad de los huevos de helminto y con ello

confirmar la calidad de diversos procesos de estabilización en lodos.

2. Muestreo, preparación y acondicionamiento de la muestra

El muestreo cons tituye una parte integral y fundamental de cualquier programa de evaluación de calidad

del lodo, por lo cual, éste deberá efectuarse de acuerdo con lo referido en el punto 5 de esta Norma.

2.1 Preparar recipientes de plástico inerte de 500 ml de boca ancha y de cierre hermético, previamente

desinfectados con cloro comercial, lavados con agua potable a chorro y enjuagados con agua destilada.

2.2 A la muestra, antes de ser procesada, se le determinará el contenido de sólidos totales (ST) en por

ciento en peso para, posteriormente, tomar en los recipientes el peso en fresco (X) que corresponda a 2 g de

ST, para todo tipo de lodos.

2.3 Mantener la muestra a una temperatura de 4°C ± 2°C hasta su llegada al laboratorio.

2.4 A partir de su toma y hasta antes de ser procesada, la muestra debe estar en refrigeración hasta

su análisis.

3. Reactivos y materiales

3.1 Reactivos

3.1.1 Acetato de etilo (C2H5 .OCOOCH3) (opcional).

3.1.2 Acetato de sodio trihidratado (CH3 COONa. 3H2O) (opcional).

3.1.3 Acido acético (CH3 COOH) (opcional).

3.1.4 Acido sulfúrico 0,1 N (H2SO4).

3.1.5 Alcohol etílico (C2 H5 OH).

3.1.6 Agua destilada.

3.1.7 Eter etílico.

3.1.8 Hipoclorito de sodio10% (NaClO).

3.1.9 Formaldehído 37% (opcional).

3.1.10 Sulfato de zinc heptahidratado (ZnSO4 .7H2 O).

3.1.11 Tween 80 al 0,1%.

3.2 Materiales

3.2.1 Barras magnéticas.

3.2.2 Bulbo de goma.

3.2.3 Embudo de plástico con diámetro de 20 cm.

3.2.4 Espátula.

3.2.5 Gradillas para tubos de centrífuga 50 ml.

3.2.6 Guantes de látex.

3.2.7 Manguera para conexión de matraz.

3.2.8 Matraces aforados Erlenmeyer de 1 L de capacidad.

3.2.9 Matraz Kitazato de 4 L.

3.2.10 Pipetas de 10 ml de plástico.

3.2.11 Pizeta de plástico de 1 L.

3.2.12 Probetas graduadas de 10 ml, 50 ml y de 1 L.

3.2.13 Recipientes de cierre hermético de 1 a 3 L de capacidad.

3.2.14 Recipientes de plástico inerte con paredes internas lisas de 3 L de capacidad.

3.2.15 Recipientes de plástico in erte, boca ancha, de 500 ml de capacidad y susceptibles de ser

esterilizados en autoclave.

3.2.16 Tamiz de 20 µm (milimicras) de poro (opcional).

3.2.17 Tamiz de 150 a 170 µm (milimicras) de poro.

3.2.18 Tapabocas.

3.2.19 Tubos de centrífuga cónicos, de plástico 50 y 200 ml (o de mayor capacidad).

4. Aparatos y/o instrumentos

4.1 Agitador de tubos con control de velocidad y adaptable a tubos de diferentes tamaños.

4.2 Autoclave capaz de operar a una presión de 1,05 kg/cm2 y una temperatura de 121°C.

4.3 Balanza granataria con intervalo de medición de 2,0 a 800 g ± 0,2 g.

4.4 Bomba de vacío con control de velocidad de succión.

4.5 Cámara de Sedgwich-Rafter o disco Doncaster.

4.6 Campana de extracción.

4.7 Centrífuga, capaz de mantener los intervalos de operación de 660 ± 300 g.

4.8 Densímetro (hidrómetro), con intervalo de medición de 1,0 a 1,4 g/cm 3.

4.9 Incubadora con capacidad para operar a una temperatura de 26°C ± 0,2°C.

4.10 Licuadora con contenedor de plástico inerte, paredes lisas y con capacidad de 2 L.

4.11 Mascarilla antigás con carbón activado o similar.

4.12 Microscopio óptico equipado para hacer iluminació n (Köhler), campo claro, con objetivos de 10

a 100 X, y platina móvil removible.

4.13 Parrilla con agitación magnética.

4.14 Potenciómetro con intervalo de medición de 0 a 14 ± 0,2 unidades de precisión.

4.15 Refrigerador con capacidad para operar a una temperatura de 4°C ± 0,2°C.

5. Procedimiento

5.1 Preparación de soluciones

Los siguientes puntos describen la secuencia del método de prueba, el cual debe realizarse conforme a lo

descrito, con el fin de minimizar sesgos en los datos obtenidos.

5.1.1 Solución ácido alcohol, homogeneizar 650 ml de ácido sulfúrico 0,1 N con 350 ml de alcohol etílico.

Almacenar la solución en un recipiente hermético.

5.1.2 Solución de formalina al 0,5%, añadir 5 ml de formaldehído al 37% y aforar a 1 000 ml con agua

destilada. Homogeneizar y almacenar en recipiente hermético.

5.1.3 Solución patrón de aceto -acético, agregar 15 g de acetato de sodio trihidratado, 3,6 ml de ácido

acético y aforar a 1 000 ml de agua destilada. Homogeneizar y almacenar en frasco hermético durante

2 a 3 meses.

5.1.4 Solución de sulfato de zinc (ZnSO4) con gravedad específica de 1,3. Disolver 800 g de sulfato de zinc

heptahidratado (ZnSO 4.7H2O) en 1 000 ml de agua destilada, mezclar en la parrilla magnética hasta

homogeneizar totalmente. Medir la densidad con el densímetro y, según sea el caso, ajustar la densidad a 1,3

agregando sulfato de zinc o agua destilada, según se requiera. Almacenar en recipiente hermético y verificar

densidad cada mes.

5.1.5 Tween 80 al 0,1%, añadir 1 ml del reactivo en 999 ml de agua destilada y homogeneizar en parrilla

de agitación hasta su completa disolución. Almacenar en recipiente hermético durante 2 a 3 meses.

5.2 Calibración de aparatos

Todos los equipos deben ser calibrados o ajustados de acuerdo con las especificacion es del fabricante,

o bien, contra equipos certificados.

5.3 Seguridad

5.3.1 Durante el procesado de la muestra se debe utilizar guantes de látex y cubreboca, para evitar

cualquier riesgo de infección.

5.3.2 Se debe lavar y desinfectar el área de trabajo, así como el material utilizado por el analista, antes y

después del ensayo.

5.3.3 La agitación de las soluciones con éter deberá realizarse en sitios ventilados o dentro de una

campana de extracción, considerando su inflamabilidad. Evitar la inhalación, el contacto con los ojos, piel o

ropa, ya que es un reactivo sumamente tóxico.

5.4 Manejo de residuos

5.4.1 Todos los residuos de la muestra analizada serán esterilizados en autoclave antes de su desecho.

5.4.2 Aquel material que sea reutilizado, pero que no pueda ser esterilizado en autoclave deberá ser

colocado en hipoclorito de sodio (10%), durante un día, antes de ser lavado.

5.5 Concentración y separación de los huevos de helminto. La recuperación de los huevos de helminto de

la muestra se realizará efectuando los siguientes pasos:

a) Por 1 minuto y con la ayuda de una licuadora homogeneizar el peso en freso que corresponda a 2 g de

ST. Utilizar para ello 200 ml de una solución de Tween 80 al 0,1%, integrando los enjuagues del recipiente

que originalmente contenía la muestra.

b) Recuperar homogeneizado y enjuagues del vaso de la licuadora en un recipiente de plástico de 2 L,

utilizar para ello 800 ml de la solución de Tween 80 al 0,1%.

c) Dejar sedimentar la muestra al menos durante 3 horas.

d) Aspirar el sobrenadante por vacío y filtrar el sedimento a través del tamiz de poro seleccionado (150 a

170 µm). Enjuagar recipiente y tamiz con 1 L de agua destilada, para lo cual se recomienda utilizar una pizeta.

El filtrado y los enjuagues se recuperan en el recipiente de plástico de 2 L.

e) Dejar sedimentar al menos durante 3 horas.

f) Aspirar el sobrenadante por vacío y recuperar sedimento y enjuagues, con agua destilada, en un tubo de

centrífuga de 200 ml o mayor capacidad.

g) Centrifugar a 660 g durante 5 minu tos.

h) Aspirar el sobrenadante por vacío y desecharlo. Resuspender la pastilla en 150 ml de la solución de

sulfato de zinc. Homogeneizar la pastilla con ayuda de un agitador de tubos y, sólo en caso de ser necesario,

utilizar aplicadores de plástico o espátula de teflón para lograr su completa disolución.

i) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos.

j) En caso de contar con un tamiz de 20 µm de poro se recomienda efectuar un segundo filtrado, cuya

finalidad es remover el detritus de menor tamaño y facilitar l a lectura de los huevos de helminto en el

sedimento final al microscopio. Para ello, filtrar el sobrenadante y recuperar la película que ha quedado

retenida sobre la malla con el volumen de agua destilada que sea necesario (utilizar pizeta), en un tubo de

200 ml de centrífuga, desechar filtrado y pasar al inciso i. En caso contrario verter el sobrenadante en un

recipiente de 2 L y romper la densidad con 1 L de agua destilada.

k) Sedimentar al menos durante 3 horas.

l) Una vez transcurrido el tiempo de sedim entación aspirar el sobrenadante por vacío y recuperar el

sedimento resultante en un tubo de centrífuga de 200 ml o mayor capacidad, incluir los enjuagues

del recipiente.

m) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos.

n) Aspirar el sobrenadante por vacío y res uspender el sedimento por agitación, con ayuda de un agitador

de tubos (si es necesario, utilizar aplicadores). La solución resultante se recupera en un tubo cónico de

centrífuga de 50 ml, incluyendo el agua destilada de enjuague.

o) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos.

p) Aspirar el sobrenadante y con ayuda de un agitador de tubos resuspender la pastilla en 15 ml de la

solución de alcohol -ácido (u opcionalmente, el patrón de aceto -acético) y, posteriormente, agregar 10 ml de

éter (o acetato de etilo, que es menos tóxico). Agitar suavemente y, de vez en cuando, destapar para dejar

escapar el gas que se desprenda. Por seguridad, realizar todo este proceso dentro de la campana de

extracción (en el laboratorio) o con mascarilla de protección antigás (en campo).

q) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos.

r) Aspirar el sobrenadante, hasta 2 mm por arriba de la parte cónica del tubo de 50 ml (aproximadamente

5 ml). Realizarlo bajo las mismas condiciones de seguridad (en el laboratorio) dentro de la campana de

extracción o (en campo) con mascarilla de protección antigás.

s) Efectuar un primer enjuague agregando H2SO4 0,1 N (o formalina 0,5%).

t) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos.

u) Aspirar el sobrenadante, dejando 5 ml y realizar un segundo enjuague agregando H 2SO4 0,1 N

(o formalina 0,5%).

v) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos.

w) Aspirar el sobrenadante dejando 5 ml del mismo.

5.6 Determinación de viabilidad y lectura al microscopio

a) Si no es necesario determinar la viabilidad, proceder a la cuantificació n, en caso contrario, incubar el

tubo con la muestra durante 4 semanas a 26°C ± 0,2°C. Dejar la tapa del tubo floja para que entre aire y, por

lo menos una vez por semana, verificar que el nivel del líquido no disminuya. Si es necesario, agregar

agua destilada.

b) Una vez transcurrido el tiempo de incubación, homogen eizar la pastilla y proceder a la cuantificación de

los huevos. Para la lectura verter el sedimento final en una celda de Sedgwich Rafter o Disco Doncaster. En

caso necesario, y para evitar la sobreposición de estructuras y del detritus no eliminado, distribuir en alícuotas

y homogeneizar con agua destilada. Sólo aquellos huevos donde se observe la larva se consideran viables.

El Anexo 1 muestra algunos ejemplos.

c) Como paso opcional, y antes de realizar la lectura al microscopio, añadir hipoclorito de sodio (10%) en

igual volumen al sedimento final y dejar reposar durante 10 minutos. Aforar con agua destilada.

d) Centrifugar a 660 g durante 5 minutos y decantar hasta dejar 5 ml del sobrenadante.

e) Realizar un segundo enjuague con agua destilada y centrifugar bajo las mismas condiciones.

Lo anterior permite una mayor claridad en el contenido interno de los huevos (especialmente de Ascaris y

Trichuris), una mejor diferenciación y, en consecuencia, un conteo más rápido.

f) Aspirar sobrenadante hasta 5 ml del volumen final.

6. Cálculos

6.1 La fórmula para calcular g es:

g = r (rpm)

k

donde:

g = fuerza relativa de centrifugación

k = constante cuyo valor es 89, 456

r = radio de la centrífuga en cm

rpm = revoluciones por minuto

6.2 Para el cálculo del por ciento de sólidos totales (ST), se utiliza el % de humedad como sigue:

% de sólidos totales = 100% -% de humedad (2)

7. Expresión de resultados

% de sólidos totales = 100% -% de humedad

7.1 Expresar los resultados en número de huevos/2 g de sólidos totales (volumen de muestra analizada).

H/2g ST (3)

donde:

H = número de huevos leídos en la muestra

gST = gramos de sólidos totales de la muestra analizados

7.2 Interferencias

7.2.1 La sobreposición de estructuras y/o detritus no eliminados en el sedimento puede dar una evaluación

errónea al dificultar la lectura. En tal caso, es importante diluir con agua destilada y hacer las alícuotas que se

consideren necesarias para que en cada una se realice el conteo.

7.2.2 La falta de experiencia en la identificación de géneros es un elemento común de sobreconteo.

7.2.3 En caso de que la muestra presente la formación de hongos durante el proceso de incubación se

recomienda remplazar el H2SO4 0,1 N por una solución de formalina 0,5%.

8. Informe de la prueba

Incluye especificar los siguientes puntos:

a) Todos los datos necesarios para la identificación completa de la muestra.

b) Los resultados, expresados de acuerdo con lo establecido en el inciso 8.

c) Cualquier suceso particular observado durante el curso del análisis, así como cualquier operación no

especificada en el método, o considerada opcional, que pueda haber influido en los resultados.