Apéndice IV — NOM-004-SEMARNAT-2002, Protección ambiental.- Lodos y biosólidos.-Especificaciones y límites máximos permisibles de contaminantes para su aprovechamiento y disposición final.

ANEXO IV

METODO PARA LA CUANTIFICACION DE Salmonella spp. EN LODOS Y BIOSOLIDOS

El presente método establece la técnica para llevar a cabo la cuantificación de Salmonella spp. mediante

la técnica de tubos múltiples o número más probable (NMP) en lodos y biosólidos, con el fin de evaluar su

calidad y la eficiencia de los tratamientos de los mismos. Este método es aplicable para la evaluación de

la calidad de los lodos y biosólidos.

1. Principio

Este método de análisis se basa en los siguientes principios:

1.1 A partir de un enriquecimiento con medios selectivos, que contienen sustancias inhibidoras, se

favorece la multiplicación de Salmonella spp., reconstituyendo a su vez la vitalidad de las células dañadas y,

de igual forma, impidiendo el desarrollo de bacterias coliformes asociadas.

1.2 Una vez realizada la selección, las bacterias presentes en una muestra pueden ser separadas por

agitación, dando por resultado una suspensión de células bacterianas, uniformemente distribuidas, a través de

diluciones sucesivas de la muestra.

1.3 La aplicación de pruebas bioquímicas que permiten conocer el perfil bioquímico de las cepas en

estudio para compararlo, con el que generalmente exhiben las cepas del género Salmonella spp.

2. Muestreo, preparación y acondicionamiento de la muestra

El muestreo constituye una parte integral y fundamental de cualquier programa de evaluación de calidad

del lodo, por lo cual, éste deberá efectuarse de acuerdo a lo referido en el Anexo II de esta Norma.

2.1 La muestra deberá ser tomada en frascos de 500 ml de capacidad, de boca ancha y previamente

esterilizados.

2.2 Las muestras deben ser colocadas en hieleras con bolsas refri gerantes o hielo inmediatamente

después de su toma.

2.3 Los tiempos de conservación en refrigeración y transporte deben reducirse al mínimo.

2.4 A la muestra, antes de ser procesada, se le determinará el contenido de sólidos totales (ST) en por

ciento en peso y posteriormente se obtendrá el peso en fresco que corresponda a 4 g de ST.

2.5 A partir de su toma y hasta antes de ser procesada, la muestra debe estar en refrigeración y no

transcurrir más de 48 horas.

3. Reactivos y materiales

3.1 Reactivos

3.1.1 Agar Hierro Lisina (LIA).

3.1.2 Agar Sulfito de Bismuto.

3.1.3 Agar Triple Azúcar Hierro (TSI).

3.1.4 Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD).

3.1.5 Alcohol etílico.

3.1.6 Caldo de Selenito Cistina.

3.1.7 Caldo de Tetrationato.

3.1.8 Cloruro de magnesio.

3.1.9 Cristales de yodo.

3.1.10 Fosfato monopotásico.

3.1.11 Solución de hidróxido de sodio 0,1 N.

3.1.12 Solución de hidróxido de sodio 1 N.

3.1.13 Solución tampón de fosfatos (agua de dilución).

3.1.14 Verde brillante.

3.1.15 Yoduro de potasio

3.2 Materiales

3.2.1 Barras magnéticas.

3.2.2 Bulbo de goma.

3.2.3 Cajas Petri estériles (100 x 15 mm.).

3.2.4 Espátula.

3.2.5 Frascos de 100 ml de capacidad con tapa de cierre hermético y capacidad de esterilizado en

autoclave.

3.2.6 Frascos de 1 L de capacidad con tapa de cierre hermética.

3.2.7 Gradillas y canastillas de acero inoxidable, matraces Erlenmeyer de vidrio, de 1 y 2 L de capacidad.

3.2.8 Guantes de látex.

3.2.9 Matraz aforado de 1 L.

3.2.10 Mechero de Bunsen, lámpara de alcohol o similar.

3.2.11 Pipetas graduadas de vidrio de 1, 5 y 10 ml.

3.2.12 Portapipeteros de acero inoxidable.

3.2.13 Tapabocas.

3.2.14 Tapones de acero inoxidable para tubos de ensayo (18 mm x 180 mm, 16 mm x 150 mm o

12 mm x 120 mm).

3.2.15 Tubos de ensayo (18 mm x 180 mm, 16 mm x 150 mm o de 12 mm x 120 mm).

3.2.16 Tubos de rosca (13 mm x 100 mm).

4. Aparatos e instrumentos

4.1 Autoclave a una presión de 1,05 kg/cm2, y una temperatura de 121°C.

4.2 Balanza analítica con intervalo de medición de 0,000 1 a 10,00 g.

4.3 Balanza granataria con intervalo de medición de 0,1 a 100 g.

4.4 Baño de agua (con agitación) con capacidad para operar a una temperatura de 44,5°C ± 0,2°C.

4.5 Estufa u horno con capacidad para operar a una temperatura de 180°C ± 10°C.

4.6 Incubadora con capacidad para operar a una temperatura de 37°C ± 0,2°C.

4.7 Incubadora con capacidad para operar a una temperatura de 41°C ± 0,2°C.

4.8 Parrilla con agitación y calentamiento.

4.9 Potenciómetro con intervalo de medición de 6,5 a 7,5 ± 0,2 pH.

4.10 Refrigerador con capacidad para operar entre 2 y 4°C ± 0,5°C.

5. Procedimiento

Los siguientes puntos describen la secuencia del método de prueba, el cual debe realizarse conforme a lo

descrito, con el fin de minimizar sesgos en los datos obtenidos.

5.1 Preparación de medios de cultivo y soluciones

5.1.1 Caldo tetrationato

Fórmula

Proteosa peptona o triptona 05,00 g

Sales biliares 01,00 g

Carbonato de calcio 10,00 g

Tiosulfato de sodio 30,00 g

Agua destilada 1 000,00 ml

Disolver los ingredientes o 16 g del medio, que se encuentra en forma deshidratada en el mercado, en

agua destilada y calentar hasta ebullición, posteriormente distribuir en volúmenes de 100 ml en recipientes

estériles y conservar entre 5 y 8°C. Antes de usar el medio, agregar 2 ml de solución de yodo yoduro y 1 ml de

solución de verde brillante 1:1 000 por cada 100 ml de caldo, a cada recipiente.

Una vez que la solución de yodo yoduro ha sido adicionada al medio, éste deberá ser utilizado de forma

inmediata. Nunca se debe volver a calentar.

5.1.2 Caldo selenito cistina

Fórmula

Triptona o polipeptona 05,00 g

Lactosa 04,00 g

Fosfato disódico 10,00 g

Selenito ácido de sodio 04,00 g

L- Cistina 00,01 g

Agua destilada 1 000,00 ml

Preparación:

Disolver los ingredientes o 23 g del medio, que se encue ntra en forma deshidratada en el mercado, en

agua destilada. Calentar hasta ebullición durante 10 minutos en un baño de agua y distribuir en volúmenes de

10 ml en tubos de ensayo, para esterilizar 10 minutos por arrastre de vapor. Verificar que el pH sea d e

7,0 ± 0,2, en caso contrario ajustar con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N.

El medio se debe utilizar el mismo día de su preparación.

5.1.3 Agar sulfito de bismuto

Fórmula

Extracto de carne de res 05,00 g

Peptona 10,00 g

Glucosa 05,00 g

Fosfato disódico (anhidro) 04,00 g

Sulfato ferroso (anhidro) 00,30 g

Sulfito de bismuto 08,00 g

Verde brillante 00,025 g

Agar 20,00 g

Agua destilada 1 000,00 ml

Suspender los ingredientes o 52 g del medio, que se encuentra en forma deshidratada en el mercado,

en 1 L de agua destilada, calentar hasta su disolución completa, agitando frecuentemente.

Verificar que el pH sea de 7,6 ± 0,2, en caso contrario ajustarlo con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N.

Enfriar a 60°C y distribuir en cajas de Petri estériles.

El medio no debe esterilizarse en autoclave, el sobrecalentamiento afecta su selectividad.

5.1.4 Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

Fórmula

Xilosa 03,75 g

L Lisina 05,00 g

Lactosa 07,50 g

Sacarosa 07,50 g

Cloruro de sodio 05,00 g

Extracto de levadura 03,00 g

Rojo de fenol 00,08 g

Agar 15,00 g

Tiosulfato de sodio 06,80 g

Desoxicolato de sodio 02,50 g

Citrato de hierro y amonio 00,80 g

Agua destilada 1 000,00 ml

Suspender los ingredientes o 52 g del medio, q ue se encuentra en forma deshidratada en el mercado,

en 1L de agua destilada. Agitar frecuentemente y dejar que hierva durante 1 minuto, evitar un

sobrecalentamiento, si bien, su reacción puede ser satisfactoria, las colonias tienden a ser muy pequeñas. E l

medio nunca se debe esterilizar en autoclave.

Verificar que el pH sea de 6,9 ± 0,2, en caso contrario ajustarlo con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N.

Enfriar a no menos de 50°C pero abajo de 60°C y vaciar en cajas Petri estériles.

5.1.5 Agar verde brillante (VB)

Fórmula

Extracto de levadura 03,00 g

Proteosa peptona número 3 polipeptona 10,00 g

Cloruro de sodio 05,00 g

Lactosa 10,00 g

Sacarosa 10,00 g

Rojo de fenol 00,08 g

Verde brillante 00,012 5 g

Agar 20,00 g

Preparación

Suspender los ingredientes o lo indicado por el medio, que se encuentra en forma deshidratada en el

mercado, en 1 L de agua destilada, mezclar bien y calentar hasta ebullición. Verificar que el pH sea de

6,9 ± 0,1 en caso contrario ajustarlo con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N.

Esterilizar en autoclave a 121°C por 12 minutos, cualquier sobrecalentamiento del medio disminuye su

selectividad. Enfriar a no menos de 50°C pero debajo de 60°C y distribuir en cajas de Petri estériles.

5.1.6 Agar S.S.

Fórmula

Extracto de carne 05,00 g

*Polipeptona 05,00 g

Lactosa 10,00 g

Sales biliares 08,50 g

Citrato de sodio 08,50 g

Tiosulfato de sodio 08,05 g

Citrato férrico 01,00 g

13,50 g Verde

Verde brillante solución al 0,1% 00,33 g

Rojo neutro 00,25 g

* La polipeptona se puede sustituir por 2,5 gramos de peptona de caseína y 2,5 gramos de peptona de

carne.

Suspender los ingredientes o 60 g del medio que se encuentra en forma deshidratada en el mercado,

en 1 L de agua destilada y calentar a ebullición hasta disolución completa. No esterilizar en autoclave.

Posteriormente verificar que el pH sea de 7,0 ± 0,2, en caso contrario ajustarlo con una solución de hidróxido

de sodio 0,1 N.

Enfriar a no menos de 50°C pero debajo de 60°C y distribuir en cajas Petri estériles.

5.1.7 Agar nutritivo**

Fórmula

Extracto de carne 03,00 g

Peptona 05,00 g

Agar 15,00 g

Agua destilada 1 000,00 ml

** Se puede sustituir por agar infusión cerebro-corazón o similar.

Suspender los ingredientes en agua, dejar reposar e ntre 5 y 10 minutos, calentar a ebullición hasta su

completa disolución, para posteriormente verificar que el pH sea de 6,8 ± 0,2, en caso contrario ajustarlo con

una solución de hidróxido de sodio 0,1 N y esterilizar a 121°C por 15 minutos. Dejar enfriar a no menos de

50°C y debajo de 60°C y distribuir en cajas Petri estériles.

5.1.8 Agar triple azúcar hierro (TSI)

Fórmula

Polipeptona 20,00 g

Cloruro de sodio 05,00 g

Lactosa 10,00 g

Sacarosa 10,00 g

Glucosa 01,00 g

Sulfato ferroso amónico 00,20 g

Tiosulfato de sodio 00,20 g

Rojo de fenol 00,025 g

Agar 13,00 g

Agua destilada 1 000,00 ml

Suspender los ingredientes o 65 g del medio, que se encuentra en forma deshidratada en el mercado, en

1 L de agua destilada; mezclar perfectamente y cal entar a ebullición, agitando ocasionalmente hasta su

completa disolución. Verificar que el pH sea de 6,9 ± 0,2, en caso contrario ajustarlo con una solución de

hidróxido de sodio 0,1 N.

Enfriar a 60°C y distribuir en volúmenes de 4 ml en tubos de rosca y e sterilizar a 121°C durante 15

minutos. Los tubos se inclinan, de manera que el medio de cultivo en el fondo alcance una altura de 3 cm y

una parte inclinada de 2 a 3 cm.

5.1.9 Agar hierro lisina (LIA)

Fórmula

Peptona o gelisato 05,00 g

Extracto de levadura 03,00 g

Glucosa 01,00 g

L Lisina 10,00 g

Citrato férrico amónico 00,50 g

Tiosulfato de sodio 00,04 g

Púrpura de bromocresol 00,02 g

Agua destilada 1 000,00 ml

Suspender los componentes o según indicaciones del medio que se encuentra en forma deshidratada en

el mercado, en 1 L de agua destilada, y calentar hasta ebullición con agitación frecuente. Verificar que el pH

sea de 6,7 ± 0,2, en caso contrario ajustar con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N.

Enfriar a no menos de 50°C pero debajo de 60°C y distribuir en volúmenes de 4 ml en tubos de rosca, para

esterilizar en presión a 121°C por 12 minutos. Posteriormente dejar enfriar los tubos en posición inclinada, de

tal modo que se obtengan columnas de medio de 3 cm y una parte inclinada de 2 cm.

5.1.10 Solución madre de tampón A

Fórmula

Fosfato monopotásico (KH2PO4) 34,00 g

Agua destilada 1 000,00 ml

Disolver el fosfato monopotásico en 500 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7,2 ± 0,2 con la solución de

hidróxido de sodio 1 N y a forar a 1 000 ml con agua destilada y esterilizar en autoclave a una presión de 1,05

kg/cm2 y una temperatura de 121°C, durante 15 minutos. Almacenar en refrigeración entre 2 y 4°C.

La solución es estable durante meses, pero se debe desechar cuando se observe turbiedad.

5.1.11 Solución madre de tampón B

Fórmula

Cloruro de magnesio (MgCl2 .6H2O) 81,00 g

Agua destilada 1 000,00 ml

Disolver el cloruro de magnesio en 500 ml de agua destilada y aforar a 1 000 ml con agua destilada y

esterilizar a 121°C du rante 15 minutos. Almacenar en refrigeración entre 2 y 4°C. La solución es estable

durante meses, pero se debe desechar cuando se observe turbiedad.

5.1.12 Solución tampón de fosfatos (agua de dilución)

Adicionar 1,25 ml de la solución patrón A y 5 ml de l a solución patrón B y aforar a 1 L con agua destilada,

para distribuir volúmenes de 9,2 ml y 36 ml en tubos de rosca y frascos con tapa de cierre hermético,

respectivamente, y esterilizar en autoclave a una presión de 1,05 kg/cm 2 y una temperatura de 121°C, durante

15 minutos. Almacenar a temperatura ambiente.

5.1.13 Solución de hidróxido de sodio 0,1 N

Fórmula

Hidróxido de sodio (NaOH) 04,00 g

Agua recién destilada 1 000,00 ml

Preparación:

Pesar 4,0 gramos de hidróxido de sodio y disolver en 1 000 m l de agua recién destilada y libre de CO 2

para abatir la carbonatación de la solución y almacenar en frasco con tapón de rosca.

5.1.14 Solución de hidróxido de sodio 1 N

Fórmula

Hidróxido de sodio (NaOH) 40,00 g

Agua recién destilada 1 000,00 ml

Preparación:

Pesar 40,0 gramos de hidróxido de sodio y disolver en 1 000 ml de agua recién destilada y libre de CO 2

para abatir la carbonatación de la solución, almacenar en frasco con tapón de rosca.

5.1.15 Solución de yodo yoduro

Fórmula

Cristales de yodo 06,00 g

Yoduro de potasio 06,00 g

Agua destilada 20,00 ml

Disolver el yoduro de potasio en el agua destilada y agregar lentamente los cristales de yodo hasta su

completa disolución y almacenar en oscuridad.

5.2 Calibración de aparatos

Todos los equ ipos utilizados deben ser calibrados o ajustados de acuerdo a las especificaciones del

fabricante o bien contra equipos certificados.

5.3 Seguridad

Durante el procesado de la muestra se debe n utilizar guantes de látex y cubre bocas, para evitar cualquier

riesgo de infección.

Se debe lavar y desinfectar el área de trabajo, así como el material utilizado por el analista, antes y

después del ensayo.

5.4 Manejo de residuos

Todos los residuos de la muestra analizada y sobrantes serán esterilizados en autoclave an tes de

su desecho.

5.5 Preparación de la muestra

a) Suspender X gramos de materia fresca que correspondan a 4 gramos de sólidos totales en 36 ml de

agua de dilución y así obtener una dilución de 10-1.

b) Mezclar durante 2 o 3 minutos, con ayuda de una par rilla de agitación, a velocidad baja (800 rpm),

hasta la completa disolución.

5.6 Enriquecimiento

a) Suspender X g de materia fresca que correspondan a 4 g de sólidos totales en 36 ml de caldo de

tetrationato, obteniendo una dilución de 10-1.

b) Mezclar du rante 2 o 3 minutos, con la ayuda de una parrilla de agitación, a baja velocidad (800 rpm)

hasta la completa disolución.

c) Incubar durante 22 ± 2 horas a 37°C ± 0,2°C.

5.7 Preparación de diluciones

a) Una vez transcurrido el tiempo de incubación, preparar las diluciones decimales seriadas transfiriendo

1 ml de caldo de tetrationato en 9 ml de agua de dilución (10 -2) y así sucesivamente hasta obtener la dilución

deseada.

b) En cada dilución se debe homogeneizar perfectamente agitando 25 veces en 7 segundos , haciendo un

arco con la muñeca de 30 cm de arriba a abajo o con un sistema de agitación que proporcione resultados

equivalentes. Es importante efectuar la agitación siempre de la misma manera, para obtener resultados

comparables y utilizar una pipeta estéril diferente, para cada una de las diluciones decimales subsecuentes.

c) Adicionar por triplicado 1 ml de cada una de las diluciones preparadas en tubos conteniendo caldo

selenito cistina correctamente etiquetados. Para aforar el líquido de la pipeta, de berá aplicarse la punta de

ésta en el interior del cuello manteniéndola en posición vertical, inclinando el tubo. Nunca se debe introducir

en la muestra, más de la tercera parte de la pipeta.

d) Incubar durante 24 ± 2 horas a 41°C ± 0,2°C.

e) Realizar la o bservación del virado de coloración, considerando un color anaranjado intenso como

positivo de la prueba correspondiente.

5.8 Aislamiento e identificación bioquímica de Salmonella spp.

a) El aislamiento y la identificación no son indispensables para la cu antificación de Salmonella spp., pero

son necesarios como control para el laboratorio de que las bacterias fueron correctamente identificadas.

b) A partir de un cierto número de tubos positivos (con virado anaranjado), con la ayuda de un asa,

sembrar por e stría para obtener colonias aisladas sobre la superficie de placas de alguno de los medios

diferenciales selectivos. Los medios utilizados pueden ser agar verde brillante, agar sulfito de bismuto, agar

XLD, agar SS.

c) Incubar a 35°C durante 24 horas.

d) Observar los cultivos para identificar las colonias sospechosas para Salmonella spp. como sigue:

—— agar verde brillante: colonias rojas o rosas rodeadas del medio rojo.

— agar bismuto de sulfito: colonias negras con o sin brillo metálico, rodeadas de un halo café que

posteriormente se transforma en negro.

— agar XLD: colonias rojas, generalmente presentan el centro negro.

— agar SS: colonias translúcidas, transparentes u opacas y algunas veces con centro negro.

e) Para la identificación bioquímica se selecci onan al menos 2 colonias típicas sospechosas de cada

placa, que se encuentren bien aisladas.

f) Tocar con un asa recta cada colonia e inocular por estría en una placa conteniendo agar nutritivo (u otro

medio similar). Incubar a 35°C ± 0,2°C por 24 horas.

g) A partir de colonias perfectamente aisladas inocular 2 tubos, uno con agar triple azúcar y hierro (TSI) y

otro con agar hierro lisina (LIA), por estría en la superficie inclinada y por picadura en el fondo. Incubar a 35°C

durante 24 horas.

h) Observar el crecimiento en los tubos y considerar positivas las colonias que den las siguientes

reacciones:

— agar TSI: en el fondo del tubo se observa virado color amarillo debido a la fermentación de la

glucosa, en la superficie del medio se intensifica el color ro jo. En la mayoría de los casos se observa

coloración negra a lo largo de la picadura, debido a la producción de H2S.

— agar LIA: se observa coloración púrpura en todo el tubo, en ocasiones se observa la producción de

H2S, con ennegrecimiento a lo largo de la picadura.

i) Existen pruebas alternas cualitativas, aunque de mayor costo, que pueden ser empleadas como es el

caso de la prueba miniaturizada API -20E y la confirmación serológica que permiten identificar la especie

y el serotipo, respectivamente.

j) Si el laboratorio lo prefiere es factible utilizar el caldo de selenito cistina como medio de enriquecimiento

y el caldo de tetrationato como medio selectivo.

6. Cálculos

6.1 El NMP de Salmonella spp. se obtiene a partir del código compuesto por los tubos c on resultado

positivo en el caldo de selenito cistina. Si se inoculan tres series de tres tubos y se utilizan volúmenes

decimales diferentes a los indicados en tablas, se obtienen el código formado por el número de tubos con

resultados positivos en las tre s series consecutivas, verificando el valor del NMP correspondiente, a través de

la siguiente fórmula:

NMP = (NMP de tablas) x (10/mayor volumen inoculado) (1)

Por ejemplo: en medio selenito cistina se obtuvo el código 3/3 para la serie de la dilución 0,1 ; 2/3 para la

serie de la dilución 0,01 y 1/3 para la serie de la dilución 0,001.

El código es de 3, 2, 1 al consultar en las tablas obtenemos un valor de 150, el resultado es:

NMP/g ST= (150) x (10/0,1) = 15 000 (2)

NMP/g ST= 1,5 x 10 4 Salmonella (3)

6.2 Cuando se inoculan más de tres volúmenes decimales, para la composición del código se utilizan los

resultados positivos correspondientes a tres series consecutivas inoculadas.

6.3 En ocasiones algunos de los posibles resultados de tubos múltiples son omit idos de las tablas del

NMP. Así los códigos como 0 -0-3, 0 -0-4 y 0 -0-5 junto con muchos otros, no están incluidos. Ello se debe a

que la probabilidad de su ocurrencia es muy baja. Si en un laboratorio dichos resultados improbables

aparecen con una frecuenci a mayor de 1%, es posible que se deban a procedimientos equivocados en el

mismo, por lo que deben ser revisados. Cuando el código del NMP no aparezca en tablas, se utilizará la

siguiente fórmula:

NMP = (Número de tubos positivos x 100) / √ [(ml muestra tubo s neg.) x (ml muestra total)] (4)

La frecuencia de obtención de resultados que no se encuentren en las tablas debe ser baja (menor 1%),

de otra forma se tendrá que revisar y confirmar.

7. Expresión de resultados

7.1 La densidad de Salmonella spp. se expres a como NMP de coliformes por g de materia seca o ST, el

cual se obtiene a partir de tablas ya establecidas, las cuales incluyen los límites de confianza al 95% para

cada una de las combinaciones de tres (o cinco) series de tubos positivos posibles.

7.2 Para su utilización se proporcionan códigos formados por tres algoritmos correspondientes al número

de tubos con resultados positivos en tres series consecutivas.

8. Informe de prueba

El informe de prueba incluye especificar los siguientes puntos:

a) Todos los datos necesarios para la identificación completa de la muestra.

b) Los resultados, expresados de acuerdo con lo establecido en el inciso 8.

c) Cualquier suceso particular observado durante el curso del análisis, así como cualquier operación no

especificada en el método, o considerada opcional, que pueda haber influido en los resultados.