Apéndice iii — NOM-004-SEMARNAT-2002, Protección ambiental.- Lodos y biosólidos.-Especificaciones y límites máximos permisibles de contaminantes para su aprovechamiento y disposición final.

ANEXO III

METODO PARA LA CUANTIFICACION DE COLIFORMES FECALES EN LODOS Y BIOSOLIDOS

El presente método establece la técnica para llevar a cabo la cuantificación del grupo coliformes fecales en

lodos y biosólidos, con el fin de evaluar la calidad y la eficiencia de los diferentes tratamientos, y es aplicable

para la evaluación de la calidad de lodos y biosólidos.

1. Principios del método

Este método de análisis se basa en que:

1.1 Las bacterias presentes en una muestra pueden ser separadas por agitación, dando por resultado una

suspensión de células bacterianas, uniformemente distribuidas.

1.2 A través de diluciones suces ivas de la muestra se obtienen inóculos de, al menos, una célula para

obtener crecimiento en el medio de cultivo (tubos positivos), y otros que al sembrarse dan resultado en por lo

menos, un tubo de la serie.

1.3 La combinación de resultados positivos y ne gativos permite realizar una estimación de la densidad

bacteriana por medio de cálculos de probabilidad.

1.4 La técnica seleccionada permite el estudio de un volumen de muestra suficiente para obtener

resultados significativos, considerando la alta turbide z que la muestra pudiera presentar a causa de la gran

cantidad de material acumulado. En caso de aplicar técnicas como filtro de membrana se correría el riesgo de

un cálculo de coliformes fecales inferior al real.

2. Muestreo, preparación y acondicionamiento de la muestra

El muestreo constituye una parte integral y fundamental de cualquier programa de evaluación de calidad

de lodo.

2.1 La muestra deberá ser tomada en frascos de 500 ml de capacidad, de boca ancha y previamente

esterilizados.

2.2 Las muestras deben ser colocadas en hieleras con bolsas refrigerantes o hielo inmediatamente

después de su toma.

2.3 Los tiempos de conservación en refrigeración y transporte deben reducirse al mínimo.

2.4 A la muestra, antes de ser procesada, se le determinará el con tenido de sólidos totales (ST) en por

ciento en peso y posteriormente se obtendrá el peso en fresco que corresponda a 4 g de ST.

2.5 A partir de su toma y hasta antes de ser procesada, la muestra debe estar en refrigeración y no

transcurrir más de 48 horas.

3. Reactivos y materiales

3.1. Reactivos

3.1.1 Alcohol etílico.

3.1.2 Caldo lauril-triptosa con púrpura de bromocresol (C.L.T.).

3.1.3 Caldo lactosado con púrpura de bromocresol (C.L.).

3.1.4 Medio EC.

3.1.5 Fosfato monopotásico.

3.1.6 Cloruro de magnesio.

3.1.7 Hidróxido de sodio.

3.1.8 Agua destilada.

3.2 Materiales

3.2.1 Asa de inoculación.

3.2.2 Barras magnéticas.

3.2.3 Bulbo de goma.

3.2.4 Espátula.

3.2.5 Frascos de 500 ml de capacidad con tapa de cierre hermético, boca ancha y con capacidad de

esterilización en autoclave.

3.2.6 Gradillas y canastillas de acero inoxidable.

3.2.7 Guantes de látex.

3.2.8 Mechero de Bunsen, lámpara de alcohol o similar.

3.2.9 Pipetas graduadas de vidrio de 1,5 y 10 ml.

3.2.10 Portapipeteros de acero inoxidable.

3.2.11 Tapabocas.

3.2.12 Tapones de acero inoxidable para tubos de ensayo (18 mm x 180 mm, 16 mm x 150 mm o de

12 mm x 120 mm).

3.2.13 Tubos de Durham (7 mm x 4,5 mm o de 5 mm x 4 mm).

3.2.14 Tubos de ensayo (18 mm x 180 mm, 16 mm x 150 mm o 12 mm x 120 mm).

3.2.15 Tubos de rosca (13 mm x 100 mm).

4. Aparatos e instrumentos

4.1 Autoclave a una presión de 1,05 kg/cm2 y una temperatura de 121°C.

4.2 Balanza analítica con intervalo de medición de 0,0001 a 10,00 g.

4.3 Balanza granataria con intervalo de medición de 0,1 a 100 g.

4.4 Baño de agua (con agitación) con capacidad para operar a una temperatura de 44,5°C ± 0,2°C.

4.5 Estufa de esterilización con capacidad para medir temperatura de 170°C ± 10°C.

4.6 Incubadora con capacidad para operar a una temperatura de 37°C ± 0,2°C.

4.7 Parrilla con agitación y calentamiento.

4.8 Potenciómetro con intervalo de medición de 6,9°C ± 0,2°C.

4.9 Refrigerador con capacidad para operar a una temperatura entre 2 y 4°C ± 0,2°C.

5. Procedimiento

Los puntos siguientes describen la secue ncia del método de prueba, el cual debe realizarse conforme a lo

descrito, con el fin de minimizar sesgos en los datos obtenidos.

5.1 Preparación de medios de cultivo y soluciones

5.1.1 Caldo lauril-triptosa con púrpura de bromocresol (C.L.T.).

Fórmula

Triptosa 20,00 g

Lactosa 05,00 g

Fosfato dipotásico (K 2HPO 4) 02,75 g

Fosfato monopotásico(KH2 PO4) 02,75 g

Cloruro de sodio(NaCl) 05,00 g

Lauril sulfato de sodio 00,10 g

Púrpura de bromocresol 00,01 g

Agua destilada 1 000,00 ml

Disolver los ingredientes o 35,6 g del medio que se encuentra en forma deshidratada en el mercado y 0,01 g

de púrpura de bromocresol, con la ayuda de una parrilla de agitación, en 1 L de agua destilada.

Verificar que el pH sea de 6,8 ± 0,2, en caso contrario ajustar con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N.

Distribuir en volúmenes de 10 ml en tubos de ensayo. Tapar con tapones de acero inoxidable y esterilizar en

autoclave a 121°C, durante 15 minutos.

El volumen final no debe variar más de 0,1 ml.

El medio ya una ve z preparado puede almacenarse a temperatura ambiente, en un lugar limpio y libre de

polvo, durante no más de una semana.

5.1.2 Caldo lactosado con púrpura de bromocresol (C.L.).

Fórmula

Extracto de carne 06,00 g

Peptona 10,00 g

Lactosa 10,00 g

Púrpura de bromocresol 0,01 g

Agua destilada 1 000,00 ml

Disolver los ingredientes o 13,0 g del medio C.L. que se encuentra en forma deshidratada en el mercado y

0,01 g de púrpura de bromocresol, con la ayuda de una parrilla de agitación, en 1 L de agua destilada.

Verificar que el pH sea de 6,9 ± 0,2, en caso contrario ajustar con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N.

Distribuir volúmenes de 10 ml del medio en tubos de ensayo. Tapar con tapones de acero inoxidable y

esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minutos.

El volumen final no debe variar más de 0,1 ml.

El medio ya una vez preparado puede almacenarse a temperatura ambiente, en un lugar limpio y libre de

polvo, durante no más de una semana.

5.1.3 Medio líquido A-1

Fórmula

Lactosa 5,00 g

Triptosa 20,00 g

Cloruro de sodio (NaCl) 5,00 g

Salicina 0,50 g

Eter p-isooctilfenil de polietilenglicol (Tritón X-100 y Haas, o equivalente) 01,00 ml

Agua destilada 1 000,00 ml

Calentar hasta la disolución de los ingredientes sólidos. Añadir el éter p-isooctifenil de polietilenglicol.

Verificar que el pH sea de 6,9 ± 0,1, en caso contrario ajustar con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N.

Distribuir volúmenes de 10 ml en tubos de ensayo con campana de Durham, tapar con tapones de aluminio.

Esterilizar en autoclave a 121°C durante 10 minutos.

Este medio se debe conservar en oscuridad a temperatura ambiente durante no más de 7 días.

5.1.4 Medio EC

Fórmula

Triptosa o tripticasa 20,00 g

Lactosa 05,00 g

Mezcla de sales biliares 1,50 g

Fosfato dipotásico (K2HPO4) 4,00 g

Fosfato monopotásico (KH2 PO4) 1,50 g

Cloruro de sodio (NaCl) 5,00 g

Agua destilada 1 000,00 ml

Disolver los ingredientes o 37,0 g del medio EC que se encuentra en forma deshidratada en el mercado,

con la ayuda de una parrill a de agitación, en 1 L de agua destilada. Verificar que el pH sea de 6,9 ± 0,2, en

caso contrario ajustar con una solución de hidróxido de sodio 0,1 N.

Distribuir volúmenes de 10 ml del medio en tubos de ensayo, conteniendo en su interior tubos de Durham

invertidos, tapar con tapones de acero inoxidable y esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minutos. El

volumen final no debe variar más de 0,1 ml.

El medio ya preparado puede almacenarse a temperatura ambiente, en un lugar limpio y libre de polvo,

durante no más de una semana.

5.1.5 Solución madre de tampón A

Fórmula

Fosfato monopotásico (KH2PO4) 34,00 g

Agua destilada 1 000,00 ml

Disolver el fosfato monopotásico en 500 ml de agua destilada, ajustar el pH a 7,2 ± 0,2 con la solución de

hidróxido de sodio 1 N y aforar a 1 L de agua destilada. Esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minutos y

almacenar en refrigeración (entre 2 y 4°C). La solución es estable durante meses. Desechar cuando se

observe turbiedad.

5.1.6 Solución madre de tampón B

Fórmula

Cloruro de magnesio (MgCl2 .6H2O) 8,10 g

Agua destilada 1 000,00 ml

Disolver el cloruro de sodio de magnesio en 500 ml de agua destilada y aforar a 1 000 ml con agua

destilada, posteriormente esterilizar en autoclave a 121°C durante 15 minut os. Almacenar en refrigeración

(entre 2 y 4°C). La solución es estable durante meses, desechar cuando haya turbiedad.

Solución tampón de fosfatos (agua de dilución).

5.1.7 Adicionar 1,25 ml de la solución madre de tampón A y 5 ml de la solución madre de ta mpón B y

aforar a 1 L con agua destilada. Distribuir volúmenes de 9,2 ml y 36 ml en tubos de rosca y frascos con tapa

de cierre hermético, respectivamente. Esterilizar en autoclave a 121°C, durante 15 minutos y almacenar a

temperatura ambiente.

5.1.8 Solución de hidróxido de sodio 0,1 N

Fórmula

Hidróxido de sodio (NaOH) 04,00 g

Agua recién destilada 1 000,00 ml

Preparación:

Pesar 4,0 g de hidróxido de sodio y disolver en 1 000 ml de agua recién destilada y libre de CO 2 para

abatir la carbonatación de la solución. Almacenar en frasco con tapón de rosca.

5.1.9 Solución de hidróxido de sodio 1 N

Fórmula

Hidróxido de sodio (NaOH) 40,00 g

Agua recién destilada 1 000,00 ml

Preparación:

Pesar 40 g de hidróxido de sodio y disolver en 1 000 ml de agua r ecién destilada y libre de CO2 para abatir

la carbonatación de la solución. Almacenar en frasco con tapón de rosca.

5.2 Calibración de aparatos

Todos los equipos utilizados deben ser calibrados o ajustados de acuerdo a las especificaciones del

fabricante o bien contra equipos certificados.

5.3 Seguridad

Durante el procesado de la muestra se debe utilizar guantes de látex y cubrebocas, para evitar cualquier

riesgo de infección.

Se debe lavar y desinfectar el área de trabajo, así como el material utilizado po r el analista, antes y

después del ensayo.

5.4 Manejo de residuos

Todos los residuos de la muestra analizada y sobrantes serán esterilizados en autoclave antes de su

desecho.

5.5 Preparación de la muestra

a) Suspender X g de materia fresca que correspondan a 4 g de sólidos totales en 36 ml de agua de

dilución y así obtener una dilución de 10-1.

b) Mezclar durante 2 o 3 minutos, con ayuda de una parrilla de agitación, a velocidad baja (800 rpm),

hasta la completa disolución.

5.6 Preparación de diluciones

Por el origen de las muestras se requieren inóculos menores a 1 ml, utilizando diluciones seriadas de

submúltiplos de 10.

a) Se preparan diluciones decimales seriadas a partir del homogeneizado resultante (10 -1) lo antes posible,

reduciendo al mínimo la sedimentación. Transferir 1 ml en 9 ml de agua de dilución (10 -2) y así sucesivamente

hasta obtener la dilución deseada.

b) Cada dilución debe ser homogeneizada perfectamente agitando 25 veces en 7 segundos, haciendo un

arco con la muñeca de 30 cm de arriba aba jo o con un sistema de agitación que proporcione resultados

equivalentes. Es importante efectuar la agitación siempre de la misma manera, para obtener resultados

comparables.

c) Se debe utilizar una pipeta estéril diferente, para cada una de las diluciones decimales subsecuentes.

Para aforar el líquido de la pipeta, deberá aplicarse la punta de ésta en el interior del cuello manteniéndola en

posición vertical, inclinando el tubo. Nunca se debe introducir, a la muestra, más de la tercera parte de la

pipeta.

d) Si una muestra o un lote de muestras va a ser analizado por primera vez, utilizar al menos cuatro series

de tres (o cinco) tubos cada una, posteriormente tres series de tres tubos serán suficientes.

5.7 Determinación de coliformes fecales

5.7.1 Prueba directa (medio A-1)

La prueba directa del medio líquido A -1 es un método de un solo paso que no requiere confirmación. Sin

embargo, su uso representa un mayor costo ya que este medio no se encuentra en forma deshidratada,

siendo necesario prepararlo a partir de sus ingredientes básicos.

a) Adicionar por triplicado 1 ml de cada una de las diluciones preparadas en tubos conteniendo líquido A -1

corrdctamente etiquetados. Incubar durante 3 horas a 35 ± 0,5° C.

b) Una vez transcurrido el tiempo los tubos se trans fieren a un baño de agua a una temperatura de

44,5 ± 0,2°C y se incuban durante otras 21 ± 2 horas.

c) La presencia de gas en cualquier cultivo en medio A -1 a las 24 horas o menos de incubación es una

reacción positiva que indica la existencia de coliformes de origen fecal.

5.7.2 Prueba indirecta

5.7.2.1 Prueba presuntiva (caldo lauril-triptosa o caldo lactosado)

a) Transferir 1 ml de las diluciones seleccionadas a cada una de las series de tubos correspondientes

conteniendo el caldo lauril o caldo lactosado e incubar a 35 ± 0,5°C.

b) Examinar cada tubo a las 24 ± 2 horas. La acidificación, con o sin producción de gas (cambio de

coloración de púrpura a amarillo), a partir de la fermentación de la lactosa en el medio de cultivo, indica una

prueba presuntiva p ositiva de la presencia de bacterias del grupo coliformes. En caso contrario reincubar

durante otras 24 horas más.

c) La acidificación del medio, con o sin formación de gas dentro de las 48 ± 3 horas, constituye una prueba

presuntiva positiva. Cuando no existe acidificación del medio, constituye una prueba.

5.7.2.2 Prueba confirmativa flama del (medio EC)

a) Los tubos positivos de la prueba presuntiva se resiembran por triple asada (esterilizada al mechero y

enfriada) en tubos de fermentación presuntiva ne gativa que contengan caldo EC e incubados a 44,5 ± 0,2°C

en baño de agua.

b) Examinar cada tubo a las 24 ± 2 horas.

c) El resultado será positivo cuando haya producción de gas a partir de la fermentación de la lactosa

contenida en el medio EC. Los tubos sin formación de gas se desechan.

6. Cálculos

6.1. El NMP de coliformes fecales se obtiene a partir del código compuesto por los tubos con resultado

positivo en el medio EC o en A -1. Si se inoculan tres series de tres tubos y se utilizan volúmenes decimales

diferentes a los indicados en la tabla, se obtiene el código formado por el número de tubos con resultados

positivos en las tres series consecutivas, verificando el valor del NMP correspondiente, a través de la siguiente

fórmula:

NMP=(NMP de tablas) X (10/mayor volumen inoculado) (1)

Por ejemplo: en medio EC se obtuvo el código 3/3 para la serie de la dilución 0,01; 2/3 para la serie de la

dilución 0,001 y 1/3 para la serie de la dilución 0,0001.

6.2 El código es de 3, 2, 1; el índice de coliformes en tabla es de 150, por lo que el resultado es:

NMP/g ST= (150) x (10/0,01) = 150 000 (2)

NMP/g ST=1,5 x 10 5 coliformes fecales (3)

6.3 Cuando se inoculan más de tres volúmenes decimales, para la composición del código se utilizan los

resultados positivos correspondientes a tres series consecutivas inoculadas.

6.4 En ocasiones algunos de los posibles resultados de tubos múltiples son omitidos de las tablas del

NMP. Así los códigos como 0 -0-3, 0 -0-4 y 0 -0-5 junto con muchos otros, no están incluidos. Ello se debe a

que la probabilidad de su ocurrencia es muy baja. Si en un laboratorio dichos resultados improbables

aparecen con una frecuencia mayor de 1%, es posible que se deban a procedimientos equivocados en el

mismo, por lo que deben ser revisados. Cuando el códig o del NMP no aparezca en tablas, se utilizará la

siguiente fórmula:

NMP = (Número de tubos positivos x 100)/ √ [(ml muestra tubos neg.) x (ml muestra total)] (4)

La frecuencia de obtención de resultados que no se encuentren en las tablas debe ser baja (< 1%), de otra

forma se tendrá que revisar y confirmar el procedimiento de la prueba.

7. Expresión de resultados

7.1. La densidad de los coliformes fecales se expresa como NMP de coliformes por g de materia seca o

ST, el cual se obtiene a partir de tablas ya establecidas, las cuales incluyen los límites de confianza al 95%

para cada una de las combinaciones de tres (o cinco) series de tubos positivos posibles. Para su utilización se

proporcionan códigos formados por tres algoritmos correspondientes al número d e tubos con resultados

positivos en tres series consecutivas.

7.2. Interferencias

La posible presencia de otras bacterias que producen ácido a partir de lactosa, lo que se elimina en la

prueba confirmativa a la temperatura de 44,5°C.

Es importante que los tubos de Durham colocados en los tubos de fermentación, una vez preparados

y esterilizados, no presenten aire en su interior. En caso contrario se pueden obtener resultados

positivos falsos.

8. Informe de prueba

El informe de prueba incluye especificar los siguientes puntos:

a) Todos los datos necesarios para la identificación completa de la muestra;

b) Los resultados, expresados de acuerdo con lo establecido en el inciso 8, y

c) Cualquier suceso particular observado durante el curso del análisis, así como cualquier operación no

especificada en el método, o considerada opcional, que pueda haber influido en los resultados.